氨基酸中在线柱后衍生检测方案(液相色谱仪)

结果与说明 袁斌武刘绿叶金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 石墨化碳柱；邻苯二甲醛；紫外检测器；液相色谱 目标 建立双三元液相色谱在线柱后衍生联合紫外检测分析氨基酸的方法。 引言 氨基酸作为构成人体的蛋白质的基本单元，同时也是生物机体所需要的重要营养素。它们在机体内具有各自独特的营养功能，在代谢过程中又密切联系，共同参加、推动和调节生命活动"。氨基酸分子中含有氨基和羧基及其他取代基团，因此氨基酸分子为极性水溶性分子，在反相色谱柱上无保留行为，无法直接进行分析，且分子中大部分取代基团无紫外吸收，这些性质对氨基酸的分析带来巨大挑战。常用的分析方法有离子交换分离后直接或间接分析，但操作复杂，部分氨基酸无法分离导致结果准确度差，或者将氨基酸衍生后采用反相色谱法分离与紫外或荧光联合分析，方法简单，但检测灵敏度受衍生过程控制，且样品基质对分离效果影响较大。石墨化碳柱(PGC)为新型的色谱柱填料，由于其具有特异的保留机理，可用于分离在反相色谱柱上无法保留的极性化合物，如氨基酸、碳水化合物等12.3。氨基酸衍生反应通常在碱性条件下与邻苯二甲醛(OPA)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-CI)、二硝基氟苯(DNFB)等试剂进行反应形成具有强烈紫外吸收的化合物，衍生反应分为柱前衍生和柱后衍生两种模式，柱后衍生较柱前衍生相比，有着良好的稳定性、结果准确。本实验在参考文献5的基础上采用石墨化碳柱直接分离氨基酸，分离后的组分与邻苯二甲醛进行衍生反应生成具有紫外吸收的化合物，衍生反应物采用紫外光度法进行定量分析来测定氨基酸 OH NH2 赖氨酸 (Lys) NH2 图1.氨基酸与邻苯二甲醛衍生反应原理 的含量。 甘氨酸(Gly， G) 丙氨酸 (Ala， A) 丝氨酸(Ser，S) 缬氨酸 (Val，V) 苏氨酸(Thr，T) 苯丙氨酸(Phe，F) 酪氨酸(Tyr，Y) 天冬氨酸(Asp，D) 谷氨酸(Glu，E) 赖氨酸(Lys，K) 图2.17种氨基酸 实验部分 仪器与试剂 U3000 双三元液相色谱仪，配置双三元泵，自动进样器，柱温箱， 二极管阵列检测器；水，乙腈，七氟丁酸均为色谱纯；邻苯二甲醛，硼酸，氢氧化钠，3-巯基丙酸均为分析纯；17种氨基酸对照品(含量：≥98.0%) 图3.柱后衍生示意图 色谱条件 色谱柱： Hypercarb， 4.6×150 mm， 5 pm(PN： 35005-154630)柱温：：30℃ 流动相： A：0.4%七氟丁酸，B：0.1%七氟丁酸-乙腈， 流速： 0.5ml/min 进样量：10pL 检测波长：UV@338nm 梯度程序：0~5 min，0%B； 5~10 min，0 →10%B； 15~20 min，10%B；20~30 min，10%→30%B； 30~40min，30%→80%B；40~43min，80%B；43~43.1min，80%→0%B；43.1~50min，0%B 试液制备 0.1N盐酸：吸取9ml盐酸，用水定容至1000 ml量瓶中，摇匀备用。 0.4M硼酸缓冲液(pH=10.0)：称取24.8g硼酸，14.1g氢氧化钠，用水稀释并定容至1000ml量瓶中，摇匀备用。 邻苯二甲醛溶液：称取200 mg邻苯二甲醛，用甲醇溶解并定容至100ml量瓶中，摇匀备用。 邻苯二甲醛衍生试液：取100ml 邻苯二甲醛溶液转移至棕色容器中，加入3-巯基丙酸(200pL)，摇匀，氮气吹扫(压力：0.01MPa)3分钟，避光密封备用。 标准品制备 分别取氨基酸对照品适量并转移至100 ml量瓶中，用0.1N盐酸溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为5.0 pmol/ml混合标准品储备液。密封并于4℃条件下避光保存。 取混合标准品储备液，用0.1N盐酸制成浓度分别为0.025，0.05，0.10，0.5，1.0 pmol/ml 的标准溶液，摇匀，作为线性范围测试溶液。密封并于4℃条件下避光保存。 样品处理 将样品用0.1N盐酸稀释至适宜进样的浓度，并用微孔滤膜(0.22pm)过滤，备用。 柱后反应条件 设置硼酸缓冲液与衍生试液的混合比例为4：1，并调节混合后的溶液流速为 0.3 ml/min，使柱后分离组分在温度为50℃的衍生管(375uL， PN： 039349)中与衍生试剂反应，再流经检测器进行分析。 专属性试验 分别进样空白溶剂(0.1N盐酸)、对照品进行分析，结果见图4，表明空白溶剂无干扰，且样品中目标峰与相邻峰达到基线分离，不影响分析结果。 由图中可以看出空白溶剂对组分分析无干扰，在对照品中17个组分，除 Glu (8号) 与Lys (9号)未能达到基线分离，其他组分之间均达至基线分离，对定量分析不产生干扰。 线性范围考察 取标准品溶液，按照浓度由低到高的顺序依次进样，测定其峰面积，并进行线性回归处理，结果见表1 表1.校准结果 名称 斜率 截距 相关系数 Gly 10.6961 1.5157 0.99861 Ser 4.3790 0.2400 0.99814 Ala 5.1996 0.2932 0.99678 Thr 2.2354 0.0548 0.99951 Cys 0.6091 0.1628 0.99722 Asp 1.5588 0.0138 0.99987 Val 1.0813 0.0401 0.99958 Glu 1.3124 -0.0427 0.99888 Lys 22.0014 0.4997 0.99956 Leu 4.4168 0.3058 0.99988 Met 2.4804 0.0779 0.99909 lle 2.0419 0.0369 0.99901 His 2.1524 0.0392 0.99956 Arg 2.4859 0.1074 0.99933 Phe 1.1856 0.0219 0.99929 Tyr 1.3711 0.0345 0.99893 Trp 0.7648 0.0075 0.99631 结果表明，氨基酸的响应值与相对应的浓度系列呈现良好线性关系。 重复性试验 取对照品溶液，连续进样6针，计算保留时间和峰面积RSD%。结果见表2 表2.重复性试验 序号 保留时间 (min) 面积 1 5.287 17.4374 2 5.276 17.4322 3 5.282 17.4232 4 5.273 17.4125 5 5.276 17.2926 6 5.288 17.1256 RSD% 0.12 0.72 图4.专属性实验图谱 测试结果表明，连续进样6针，保留时间和峰面积的偏差均符合要求，表明该方法重现性良好，但仔细研究会发现峰面积呈现逐渐降低的趋势，这是由于衍生试剂的不稳定而引起衍生效率降低所导致，与文献所描述结果一致，同时建议对衍生试剂要进行脱氧、避光和低温密封存放等保护措施来减缓衍生试剂降解速度。 样品测定与加样回收试验 氨基酸注射液(5%)：取2ml注射液用0.1N盐酸稀释至10ml，摇匀，用微孔滤膜(0.22pm)过滤，作为供试液。同时平行制备加标供试液。结果见表3 表3.氨基酸注射液分析结果 名称 含量 (umol/ml) 加标量 (pmol/ml) 总含量 (umol/ml) 回收率(%) Gly 0.1012 0.05 0.1518 101.2 Ser 0.1151 0.05 0.1652 100.2 Ala 0.1245 0.05 0.1748 100.6 Thr 0.1099 0.05 0.1611 102.4 Cys ND 0.05 0.0503 100.6 Asp 0.0307 0.05 0.0812 101.0 Val 0.0251 0.05 0.0745 98.8 Glu ND 0.05 0.0508 98.6 LyS 0.3735 0.05 0.4238 100.6 Leu 0.0842 0.05 0.1352 102.0 Met 0.0358 0.05 0.0862 100.8 lle 0.0268 0.05 0.0762 98.8 His 0.0319 0.05 0.0811 98.4 Arg 0.0373 0.05 0.0868 99.0 Phe 0.0326 0.05 0.0818 98.4 Tyr 0.0288 0.05 0.0778 98.0 Trp 0.0443 0.05 0.0937 98.8 通过前述实验结果看，除Glu 与 Lys未能达到基线分离，结果准确度会受到影响，其他组分的分析不会受到干扰。通过对方法学的考察，结果表明该方法具有良好的专属性，线性范围，重现性及准确度，可用于氨基酸的分析。 本方法中衍生试剂为强碱性缓冲液，对金属材质部件有腐蚀作用，为保护色谱系统并延长使用寿命，在完成每次测试后立即用纯净水清洗系统至中性并保存在有机溶剂中。在使用本方法前，强烈建议按照下面程序对不锈钢系统进行钝化： 1)将保护柱、色谱柱和流通池与色谱系统断开， 2)将系统依次用水一异丙醇一水冲洗，以除掉表面残余有机物， 3)再用6N硝酸以1ml/min流速冲洗30分钟进行表面钝化， 4)再用水清洗色谱系统， 5)连接保护柱、分析柱和流通池后即可使用。 ( [1]王镜岩朱圣庚徐长法， 生物化学(第三版)，高等 教育出版社：北京，2002 ) ( [2] Paul Ross， Ronald Majors， LCGC Asia Pacific， Volume 3 N umber 1(2002)： 1 0~15 ) ( [3] C. West， C . E lfakir， M. Lafosse， Journal of Chromatography A.1217(2010 ) ：3201~ 3 216 ) ( [ 4] M. Lores， 0 . Cabaleiro， R. Ce l a， Tr e nds in A nalytical Chemistry， V olume 1 8 Issue 6(1999)：392~ 4 00 ) ( [5] USP Convention， U S P 36 General C h apter <1052> Biotechnology- Derived Articles-Amino Acids Analysis ) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-   常用的分析方法有离子交换分离后直接或间接分析，但操作复杂，部分氨基酸无法分离导致结果准确度差，或者将氨基酸衍生后采用反相色谱法分离与紫外或荧光联合分析，方法简单，但检测灵敏度受衍生过程控制，且样品基质对分离效果影响较大。石墨化碳柱（PGC）为新型的色谱柱填料，由于其具有特异的保留机理，可用于分离在反相色谱柱上无法保留的极性化合物，如氨基酸、碳水化合物等。