红枣发酵酒中挥发性成分检测方案(毛细管柱)

超北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923食品科学 2017， Vol.38， No.04※成分分析197 198※成分分析 HS-SPME-GC-O-MS分析红枣发酵酒中的挥发性成分 焦 娇，李 凯，李树萍，苗潇潇，张生万* (川西大学生命科学学院，山西太原 030006) 摘 要：采用顶空固相微萃取、.气相色谱-嗅闻-质谱 (gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry：GC-O-MS)联用，对红枣发酵酒中易挥发性成分进行萃取条件及GC-MS分离检测条件的系统研究，并采用气味活度值结合香气强度值评价了主要成分对总体香味的贡献。选定的顶空固相微萃取最优参数为：50/30 um DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、样品用量8.0 mL/20.0 mL样品瓶、加盐量0.40 g/mL、萃取温度55℃、萃取时间40 min、平衡时间20 min、解吸时间5 min。选用Rtx-Wax色谱柱，经GC-O-MS联用对红枣发酵酒挥发性成分进行分析，共检出108种组分，结构推断86种，占挥发性成分总峰面积的97.09%。其中，乙酸-3-甲基丁酯、3-甲基丁醇、己酸乙酯、2-己烯酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸、辛醇、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、戊酸、乙酸-2-苯乙酯、己酸、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇、辛酸、n-癸酸为红枣发酵酒的主体香气成分。其结果为红枣发酵酒的质控及香味评价提供一定理论依据。 关键词：顶空固相微萃取；气相色谱-嗅闻-质谱；红枣发酵酒；挥发性成分 Analysis of Volatile Compounds in Fermented Chinese Jujube Wine by Headspace Solid Phase Micro-Extraction andGas Chromatography-Olfactometry-Mass Spectrometry JIAO Jiao， LI Kai， LI Shuping， MIAO Xiaoxiao， ZHANG Shengwan"* (College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China) Abstract： The volatile compounds in fermented Chinese jujube wine were analyzed by headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME) and gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry (GC-O-MS). Extraction and GC-MSconditions were systematically studied and the contributions of the main components to the overall aroma of fermentedChinese jujube wine were evaluated by odor activity value (OAV) combined with aroma intensity value. The optimalextraction parameters were achieved on Rt-Wax column under the following conditions： 50/30 um poly two vinyl benzene/carbon molecular sieve/poly two methyl siloxane (DVB/CAR/PDMS) solid-phase micro extraction fiber， extraction of 8.0 mLof sample in a 20.0 mL vial for 40 min at 55 ℃ with the addition of 0.40 g/mL of NaCl， 20 min equilibration and 5 mindesorption. The results showed that a total of 108 compounds were isolated the structures of 86 compounds of which wereidentified by HS-SPME-GC-O-MS， accounting for 97.09% of the total volatile substances. Evaluation of OAV and aromaintensity values indicated that 1-butanol 3-methyl-acetate， 3-methyl-1-butanol， hexanoic acid ethyl ester， 2-hexenoic acidethyl ester， heptanoic acid ethyl ester， acetic acid， 1-octanol， decanoic acid ethyl esterl， benzoic acid ethyl ester， pentanoicacid， acetic acid 2-phenylethyl ester， hexanoic acid， benzyl alcohol， benzenepropanoic acid ethyl ester， phenylethyl alcohol，octanoic acid， and n-decanoic acid were the main aroma components. These results could provide a theoretical basis forquality control and aroma evaluation of fermented Chinese jujube wine. Key words： headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME)； gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry(GC-O-MS)； fermented Chinese jujube wine； volatile compounds DOI：10.7506/spkx1002-6630-201704032 中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2017)04-0197-07 ( 收稿日期：2016-07-25 ) 基金项目：2015重点学科经费汾酒发酵工艺优化项目 ( 作 者 简介：焦娇(1990一)，女，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail： 1147262408@qq.com ) * 作者网(www.yuweichina邮食water1102@163.com 北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：189118499232017， Vol.38， No.04 食品科学 引文格式： 焦娇，李凯，李树萍，等.HS-SPME-GC-O-MS分析红枣发酵酒中的挥发性成分[J].食品科学，2017，38(4)： 197-203 DOI：10.7506/spkx1002-6630-201704032. http：//www.spkx.net.cn JIAO Jiao， LI Kai， LI Shuping， et al. Analysis of volatile compounds in fermented Chinese jujube wine by headspace solidphase micro-extraction and gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry[J]. Food Science， 2017， 38(4)： 197-203. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201704032. http：//www.spkx.net.cn 红枣又名中华大枣、枣、胶枣、刺枣，是鼠李科枣属植物枣树的果实，营养价值极高，享有“百果之王”、 “活维生素丸”，，“天然维生素”的美誉11-31。以红枣为原料，经分选、破碎、低温发酵、陈酿，，调制而成的低酒度、高营养滋补饮品——红枣发酵酒，既有陈酿的香味，又保留了红枣原有的营养成分，满足了现代人对绿色、天然、健康食品的追求。因此，红枣发酵酒具有良好的发展前景和研究价值。 红枣发酵酒易挥发性成分是构成和影响其风味、品质的主要因素，因此，香气成分的分析对于评价产品质量和获得最优的发酵条件具有重要的意义4。目前，对红枣发酵酒的研究主要集中在其加工工艺的优化，如武运等对新疆哈密红枣酒酿造的工艺进行了研究，郑佩通过枣汁浸提方法比较了不同工艺对枣酒品质的影响，贾琦对红枣发酵酒发酵菌种的筛选进行了研究。李丹等^报道了采用溶液萃取法提取金丝小枣酒中的香气成分，经气相色谱-质谱联用分离出53个峰，结构推断出35种化合物。而有关气相色谱-嗅闻-质谱 (gaschromatography-olfactometry-mass spectrometry， GC-O-MS)对红枣发酵酒的易挥发性成分中香气活性成分的研究鲜见报道。 目前，顶空固相微萃取 (headspace solid phase micro-extraction， HS-SPME) 结合GC-MS联用是集微量成分富集、有效分离和结构推断较有效的方法，广泛用于酒类产品香味成分分析[8-11]，该法结合嗅闻更能有效地揭示产品香味特征112-13]。 本实验采用HS-SPME-GC-O-MS联用针对红枣发酵酒中的易挥发性成分进行萃取条件及GC-MS联用分离检测的系统研究，并采用气味活度值 (odor activity value，OAV)结合香气强度就特征香味成分对总体香味的贡献进行评价，其结果为红枣发酵酒的质控及香味评价提供理论依据。 材料与方法 1.1 材料与试剂 红枣发酵酒 山西省万里红酒业有限公司； NaCl(分析纯) 天津市光复科技发展有限公司； C，~C40正 构烷烃(色谱纯) 上海安谱科学仪器有限公司；2-乙基丁酸(色谱纯) 美国Acros Organics公司。 1.2 仪器与设备 SPME 50/30 um聚二乙烯苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS)、65 um PDMS/DVB、75 um CAR/PDMS、100 pm PDMS萃取头 美国Supelco公司；7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司； DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸易有限公司； ODP3嗅闻仪 德国Gestel公司。 1.3 方法 1.3.1 单因素试验设计 选取对萃取效果影响较大的因素，分别进行单因素试验，以峰个数和总峰面积为主要考察指标，确定试验萃取头(50/30 um DVB/CAR/PDMS、65 um PDMS/DVB、75 um CAR/PDMS、100 um PDMS)、样品用量(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL)、萃取温度(35、45、55、65、75℃)、萃取时间(20、30、40、50、60 min)、平衡时间(10、20、30、40、50min)、解吸时间(2、3、4、5、6min)。采用控制变量法，分别在其他因素不变的情况下，考察每一因素对峰个数和总峰面积的影响。 1.3.2 正交试验设计 表1 正交试验因素与水平 Table1 Coded levels and actual levels of independent variables used inorthogonal array design 水平 因素 A萃取头种类 B样品 C萃取 D萃取 用量/mL 温度/℃ 时间/min 1 65 um PDMS/DVB 4.0 55 30 2 50/30 um DVB/CAR/PDMS 6.0 65 40 3 75 um CAR/PDMS 8.0 75 50 如表1所示，采用四因素三水平的正交试验，最终确定HS-SPME-GC-O-MS分析红枣发酵酒易易挥发性成分的条件。 1.3.3 HS-SPME的分离富集 准确移取8.0mL红枣发酵酒置于20.0mL顶空瓶中，按0.40 g/mL的质量浓度加入NaCl， 并加入搅拌子，用带有橡胶隔垫的瓶盖密封，将其置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，在55℃恒温条件条搅拌平衡20 min， 然后将 已老化好的50/30 umDVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中距液面1cm处，萃取40 min， 待GC-O-MS分析。 1.3.4 GC-O-MS分析条件 GC条件： Rtx-Wax色谱柱(30m×0.25 mm，0.25 um)；升温程序：：初温33℃，保持3 min， 以12℃/min的速率升至45℃，保持1 min， 以19℃/min的速率升至70℃，保持1 min， 以6℃/min的速率升至140℃，以10℃/min的速率升至230℃，保持5 min；溶剂延迟6 min； 进样口温度250℃；载气(He)流速1.3mL/min；不分流。 MS条件：电子电离源；、；日电子能量70eV；离子源温度230℃；；四极杆温度150℃；；质量扫描范围m/z33~500；质谱库为NIST 05；扫描模式为全扫描。 嗅闻方法：ODP3嗅闻仪的传输线温度250℃；补充气为N；接口温度为200℃。 1.3.5 定性与定量分析 按1.3.4节GC-O-MS联用分析条件，将HS-SPME后的萃取头插入GC进样口，解吸5 min， 进行分析。 1.3.5.1 定性分析 采用MS、保留指数 (retention index， RI)和嗅闻3种方法进行结构推断。MS是通过人工解析并使用计算机标准质谱库NIST 05进行对照确定。RI定性是在与样品测定相同的GC条件下，通过对C，~C40正构烷烃的色谱扫描，按文献[14]方法计算得到各化合物的RI，并与相应文献值对照。嗅闻是将评价员描述的化合物香味特征与文献[15]报道结果对比。 1.3.5.2 定量分析 对分离检出的化合物采用峰面积归一法对各物质的相对含量进行定量分析。并在8.0mL红枣发酵酒中，加入0.04 mL内标溶液，对其主体香气成分的含量采用内标法6进行定量分析。 内标溶液的配制：称取0.0139g2-乙基丁酸，加入10.0 mL 8%乙醇溶液，摇匀即为内标溶液。 1.3.6 OAV的计算及嗅闻分析 1.3.6.1 OAV的计算 根据内标法对红枣发酵酒主体香气成分进行的定量分析结果和各化合物在勿中的嗅觉阈值，按下式计算OAv17-19。 式中：C是根据内标法计算出的该化合物的质量浓度/(ug/L)；；OT是该化合物在水溶液中的嗅觉阈值/(ug/L)。 1.3.6.2 嗅闻分析 在1.3.4节GC-O-MS分析条件下测定，由3位评价员在嗅闻仪检测口嗅闻各组分的气味，并记录得到香气成分的RI、香味特征和强度，强度分为0、1、2、3、4 五个等级，根据0表示无、1表示微弱、2表示中等、3表示较明显、4表示非常明显来打分，并尽可能地对所感觉到的香味进行描述， 与文献报道的化合物香气特征进行对比。 2 结果与分析 2.1 HS-SPME条件的选择 2.1.1 萃取头的选择 表2 不同萃取头对萃取效果的影响 Table 2 Effect of different SPME fibers on the extraction efficiency 指标 萃取头 50/30 um DVB/CAR/PDMS 65 um PDMS/DVB 75 um CAR/PDMS 100 um PDMS 峰个数 91 82 70 55 总峰面积 1.95×10 1.46×10 9.04×10° 5.76×10° 由表2可知，萃取头吸附剂PDMS含量越高效果越差，故50/30 um DVB/CAR/PDMS萃取头分离富集得到的有效峰个数最多，且总峰面积最大，故本实验选择该萃取头为最佳萃取头。 2.1.2 样品用量的选择 图1 样品用量对萃取效果的影响 Fig.1 Effect of different sample amounts on the extraction efficiency 从图1可知，样品用量在2.0~8.0mL之间，随样品用量的增加总峰面积和峰个数逐渐增加，当样品用量为8.0mL时其值达到最大。当样品用量增至10.0mL时，总峰面积稍有增加，但峰个数明显减少，这是由于样品用量较大时，色谱峰的分离度降低所致。故样品用量选为8.0 mL。 2.1.3 萃取温度的选择 图22萃取温度对萃取效果的影响 Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency 200 如图2所示，温度从35℃升到65℃，峰个数和总峰面积逐渐增大，继续升温至75℃时峰个数明显减少，可能是由于随萃取温度不断升高，挥发性物质从液体中溢出量不断增加，兰当萃取头吸附量达到饱和时，再升高温度，不但萃取头吸附量不会增加，反而萃取头吸附相对较强物质的量有所增加，吸附相对较弱物质的量有所减少，甚至大的峰会把较弱的峰所掩盖，致使总峰个数有下降。所以，萃取温度选为65℃。 2.1.4 萃取时间的选择 图3 萃取时间对萃取效果的影响 Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction efficiency 从图3可知，萃取时间在20~40 min之内，随着萃取时间的延长峰个数和总峰面积增加，当达到40 min时，峰个数和总峰面积最大。再延长萃取时间，体系可能会发生类似增加萃取温度的现象，导致总峰个数减少。故萃取时间选择40 min。 2.1.5 平衡时间的选择 图4 平衡时间对萃取效果的影响 Fig.4 Effect of equilibrium time on the extraction efficiency 平衡是在一定温度条件下，使样品中的挥发性物质转移到空气中，达到饱和，以便萃取。由图4可知，平衡时间为20 min时，红枣发酵酒中挥发性物质的萃取效果相对较好，20 min之后，峰个数和总峰面积影响不大，故平衡时间选为20 min。 2.1.6 解吸时间的选择 解吸时间延长，有利于解吸，但也可能会使萃取纤维头上的一些物质分解，故需选择合适的解吸时间。如图5所示，解吸时间为5 min时峰个数和总峰面积达到最大。故解吸时间选为5 min。 图5 解吸时间对萃取效果的影响 Fig.5 The effect of different desorption times on the extraction 2.1.7 正交试验结果 因解吸时间、平衡时间对萃取效果影响不太明显，但萃取头种类、样品用量、萃取时间及萃取温度相互之间对萃取效果有较大的影响，所以在单因素试验的基础上，设计正交试验，如表3、4所示。 表3 正交试验设计及结果 Table 3 Orthogonal array design with experimental results 试验号 A萃取头种类 B样品用量 C萃取温度 D萃取时间 峰个数 总峰面积 1 1 1 1 1 85 1.40×10 2 1 2 2 2 86 1.43×10” 3 1 3 3 3 92 2.13×10 4 2 1 2 3 98 1.48×10 5 2 2 3 1 93 1.89×10 6 2 3 1 2 108 2.59×10 7 3 1 3 2 75 1.13×10 8 3 2 1 3 73 1.20×10 9 3 3 2 1 78 1.20×10 表4 正交试验对峰个数和总峰面积影响极差分析 Table 4 Range analysis of peak number and total peak area 极差 峰个数 总峰面积 A萃取头种类 B样品用量C萃取温度 D萃取时间A萃取头种类B样品用量 C萃取温度 D萃取时间 k 88 83 89 87 1.65X10 1.34X10 1.73X10 1.50×10 k 98 85 84 90 1.99×10 1.51×10 1.37×10 1.72×10 75 93 88 84 1.18×10 2.00×10 1.72×10 1.60×10 R 23 10 5 6 8.10X10 6.36×10° 3.60×10° 2.20X10° 较优水平 B C D， B， C D 主次因素 A>B>D>C A>B>C>D 由表4可知，当以峰个数为考察指标时，各因素对萃取效果的影响大小顺序为A>B>D>C，即萃取头种类>样品用量>萃取时间>萃取温度，较优组合为AB，CD。当以总峰面积为考察指标时，各因素对萃取效果的影响大小顺序为A>B>C>D，即萃取头种类影响最大，样品用量次之，较优组合为AB，C，D。综合考虑，最优组合选为ABCD， 即选用50/30 um DVB/CAR/PDMS萃取头，样品用量8.0mL在55℃萃取40 min。经验证，得到108个色谱峰，总峰面积为2.59×10°。 2.2 红枣发酵酒易挥发成分分析 对待测红枣发酵酒，按1.3.3节方法进行分离富集，并按1.3.5节方法进行分析，其总离子流色谱图如图6所示，分析结果见表5。 *.萃取头吸附层流失所致；未标注序号的峰是由于区域峰过密不便于标注，但其序号与表5序号一致。 图6 红枣发酵酒挥发性成分总离子流色谱图 Fig.6 Total ion current chromatogram of volatile components offermented Chinese jujube wine 表5 HS-SPME-GC-O-MS分析红枣发酵酒挥发性成分结果 TableH5S-SPME-GC-O-MS analysis of volatile components offermented Chinese jujube wine 3-甲氧基-1-丙醇 MS、RI 8824.025 1899/1 892 苯丙酸乙酯 98 2.10 MS、RI、Odor 水先生电话：18911849923 202 续表5 保留 序号时间/min RI 实验值/文献值2028 化合物 匹配度/% 相对含量/% (归一化法) 结构鉴定 方法 8924.143 1908 1-甲基萘 94 0.19 MS 9024.303 1921/191720 苯乙醇 96 4.73 MS、RI、Odor 9124.445 1932 二氢-5-丁基-2(3H)-呋喃酮 90 0.15 MS 9224.686 1951/19532 庚酸 92 1.01 MS、RI 93224.848 1964 2-己烯酸 95 0.12 MS 9425.023 1978 1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮 95 0.07 MS 9525.098 1984 2.6-二甲基萘 98 0.06 MS 9625.358 2006/2007 苯酚 96 0.07 MS、RI 97225.484 2016 2，6-二甲基萘 95 0.03 MS 9825.553 2022 1，6-二甲基萘 95 0.06 MS 9925.716 2037 二苯基甲烷 64 0.04 MS 10025.828 2 046 二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃酮 90 0.16 MS 10125.952 2057/206124 辛酸 95 5.53 MS、RI、Odor 10226.634 2117 一 0.11 10326.976 2149 一 0.12 10427.106 2161 一 0.20 一 105228.198 2266/22682 n-癸酸 98 1.58 MS、RI、Odor 10628.603 2304 2.4-双(1，1-二甲基乙基)-酚 97 0.37 MS 107330.127 2428 苯酸 96 0.15 MS 108330.795 2476/2486 十二烷酸 99 0.04 MS、RI 注： Odor.闻香法；一.结构未确定。 由图6、表5可知，从红枣发酵酒中共分离得到108组组分，其中推断结构的有86种，占总峰面积的97.09%，其中酯类、醇类和酸类相对含量较高，是红枣发酵酒的主要风味组分。主要来源于发酵过程中微生物和酶的代谢产物“。其中酯类化合物27种(相对含量36.83%)，主要乙酸酯类化合物，其中己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯和苯丙酸乙酯相对含量较高，合计占总酯含量的72.20%；醇类化合物16种(相对含量29.31%)，其中3-甲基丁醇、苯乙醇、2，3-丁二醇和丙醇相对含量较高，合计占总醇含量的89.87%；配酸类化合物14种(相对含量21.67%)，其中乙酸、辛酸和己酸相对含量较高，合计占总酸含量的79.79%；其余化合物相对含量较低，其中醛酮类化合物12种(相对含量3.90%)、烯烃类化合物6种(相对含量0.64%)以及其他类化合物11种(相对含量4.74%)。这些易挥发成分中相对含量在1%以上的主要是丁酸乙酯(1.06%)、丙醇(2.13%)、乙酸-3-甲基丁酯(1.21%)、3-甲基丁醇(16.07%)、、己酸乙酯(13.14%)、庚酸乙酯(2.63%)、辛酸乙酯(8.72%)、乙酸(8.81%)、糠醛(1.79%)、、7-辛烯酸乙酯(1.25%)、2，3-丁二醇(2.57%)、癸酸乙酯(2.02%)、甲氧基苯基肟(3.18%)、己酸(2.95%)、苯丙酸乙酯(2.10%)、苯乙醇(4.73%)、庚酸(1.01%)、辛酸(5.53%)、n-癸酸(1.58%)。 2.3 红枣发酵酒特征香气分析 根据嗅闻实测香气，与文献[5，8-9，12]中的描述进行对比，并利用各成分香气特征与其强度绘制红枣发 酵酒主要香气分布雷达图，同时用香气强度值和OAV确定了红枣发酵酒的特征香气成分及其贡献程度，结果见图7、表6。 图7 红枣发酵酒主要香气分布雷达图 Fig.7 Radar diagram of the main aroma compounds of fermentedChinese jujube wine 从图7各物质的香气强度可知，红枣发酵酒的香气主要由果香、枣香和窖香组成，花香味的苯甲醇和苯乙醇对红枣发酵酒整体香气起到补充作用，其他香气对红枣发酵酒也起到了一定的辅助作用。另外，乙酸、己酸、戊酸和n-癸酸呈不好闻的酸臭味，分布面积小，香气强度低，对其主体香气影响微弱。 表6 红枣发酵酒香气成分闻香特点及OAV Table 6 Aroma characteristics and OAV of fermented Chinesejujube wine 香气成分 香味特点 香气强1含量/(pg/L) 阈值/ 度值 (内标法) (ug/L)129-311 OAV 乙酸-3-甲基丁酯 水果香 2 41594.56 3.6 11 554.05 3-甲基丁醇 杂醇辛辣味 430420.45 己酸乙酯 浓香酒曲味 4 177114.56 177114.56 2-己烯酸乙酯 果香、甜香、菠萝蜜味道 3874.46 庚酸乙酯 果香、青香、菠萝蜜 4 26182.65 2.2 11 901.20 刺鼻的味 296181.04 油脂味，柑橘、玫瑰气味 3036.07 110~130 23.35 癸酸乙酯 酿酒香味、葡萄酒香 50298.17 1.5 33532.12 苯甲酸乙酯 葡萄香、水果香 8145.23 60 135.75 戊酸 苦味、臭味 6267.54 3000 2.09 乙酸-2-苯乙酯 甜枣味 13336.79 己酸 汗臭味 54 595.88 3000 18.20 苯甲醇 花香 3 1611.23 10000 0.16 苯丙酸乙酯 甜、红枣味 4 42391.54 苯乙醇 清甜的玫瑰花香，蜂蜜味面包香 97283.23 10000 9.73 辛酸 酸败、汗臭、酸味 2 129510.72 3000 43.17 n-癸酸 酸败味 1 28786.33 10000 2.88 由表6和图7可知，通过嗅闻得到17种红枣发酵酒特征香气成分。这些物质中， OAV大于500的有4种，分别是乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯，说明水果香和酒香为红枣发酵酒的主体香味对红枣发酵酒香气贡献程度较大，1

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