单克隆抗体中流体力学半径、聚集态检测方案(激光粒度仪)

热稳定性与PH和浓度的函数关系 蛋白构象的热稳定性不仅取决于蛋白本身的性质，还取决于溶剂组成以及蛋白制备的溶度。使用DynaPro®板读数器，可将不同条件下的蛋白分配到96孔，384孔或1536孔板中，从而测定蛋白质稳定性与温度，pH，浓度和赋形剂分布的函数关系。 在这个实验中，以在PH分别为8.5和9.5，浓度为50mM的bis-tris-propane为缓冲液，制备浓度介于0.47-15mg/ml单克隆抗体溶液，检测12种不同条件下单克隆抗体的热力学稳定性。每一种条件下的单抗，抽取20ul的溶液到384孔的微量滴定板上，每个样本三个平行，并用石蜡油密封以防止蒸发。以0.1℃/min的速度将整块微孔板的温度从25℃升高到85℃，测定每个微孔里抗体的流体力学半径。 当PH为8.5时，随着温度的上升，蛋白很明显的聚集成大的复合物，流体力学半径在75℃时，介于80到800nm之间（图1）。Dynamics®软件被用于分析流体力学半径突变的温度点。在所有的浓度条件下，突变温度均为55.9+0.9°C，突变温度时的流体力学半径为5.3+0.2 nm（图1）。相比而言，当PH为9.5，温度高于65℃时，流体力学半径从5.4+0.4转变到第二个更高、但更稳定的值。这个现象是典型的去折叠而不是聚集（图2）。Dynamics®被用于拟合每种浓度的S曲线关系，并在S曲线的中点得到一个温度和半径（图2，插图）。这里，我们观察到曲线中点温度和半径有一个显著的浓度依耐性。尤其是，在中点温度处的半径增加了30%，最终半径在浓度的影响下增加了50%。尽管PH为9.5时阻止了在PH为8.5时发生的高度聚集现象，但是从这些S曲线中的数据可以推测在高浓度时，蛋白依然有形成低聚物或者变成其他不稳定物的倾向。 综上所诉，DynaPro® Plate Reader成功地测量了作为温度的函数的36种不同样品的流体力学半径。这种复合方法可以容易地应用到各种其他制定条件，用于快速表征蛋白质行为而不会有过度的体力劳动要求。 Protein Solutions 图1 pH定为8.5时，抗体制剂的流体动力学半径与温度和浓度的函数关系 。 温度> 56°C时， 高聚物形成是很明显的。 图2 在PH为9.5时，各种浓度条件下抗体，其流体动力学半径作为温度的函数表现出S曲线关系。 中点温度和半径作为浓度的函数的变化，可以推测非特异性吸引或低聚。        基于高容量样品自动化分析的设计理念，DynaPro打破了以往一次一个的手动样品分析模式。现在，您可以花更少的时间和更少的精力来收集更多的数据。DynaPro平板读取器能够进行96或384孔板的自动DLS分析，不需要手工参与。从此不再需要预先清洗石英杯了。现在，你只需要使用一次性的多孔平板，在一天时间内完成很多样品的测定工作。平板读取器甚至能够连接到您已有的DynaPro主仪器上，通过自动的测量来提高您的效率。技术参数： 测量尺度范围（nm）：1 - 1000；  最小的样品浓度：0.125mg/mL； 散射角（°）：150；  最小的样品体积（μL）：4uL；  一次处理的样品数：96 或 384 或1536个；  温度范围（°C）：同环境温度；  激光波长（nm）：830；  激光功率（mW）：0 - 50mW（可程控）； 应用范围：     配方筛选；    平衡常数测定；    聚集温度测定；大量用于制药和生物技术的研究及开发等领域，包括小分子凝集分析（分子杂交抑制因子）、疫苗研究、脂质颗粒大小测定、抗体构象分析等。