蛋白中定量分析检测方案(紫外分光光度)

结论 介绍 使用LAMBDA UV/Vis分光光度计测定总蛋白：Lowry法 Lowry和Biuret法是蛋白定量的标准方法。尽管后者的灵敏度更高，并在探索性工作中使用，但由于其(1)组合试剂的稳定性差，(2)颜色重复性差(低蛋白浓度时尤其明显)，且(3)蛋白浓度和颜色响 应的关系非线性，制约了其应用。Ohnishi和Barrl为Lowry过程改进并简化了Biuert组合溶液，同时提高了其稳定性。本应用报告描述了改进的Lowry过程，进行蛋白分析。 原理 Lowry方法中出现的蓝色是由于(1) Cu²+和肽键的反应，和(2)螯合剂(酚试剂， Folin试剂， Lowry试剂，或者Folin-Ciocalteu试剂)的还原，这包括络氨酸和色氨基酸中的磷钼酸在蛋白上的沉淀。 试剂和仪器 1、蛋白标准物 (BSA) 1mg/ml 2、Biuret试剂：硫酸铜75mmol/L， 氯化钠94mmol/L，酒石酸钠，碘，碳酸盐 3、Folin-Ciocalteu's酚试剂： 2.0N 4、未知蛋白 5、氯化钠溶液(0.85%) 6.LAMBDA 465 UV/Vis分光光度计 7、UV Lab软件 8、比色皿(10mm光程) 实验过程 1、准备蛋白溶液：依照表1，在6个试管中混合蛋白和盐溶液。 2、加入2.2ml Biuret试剂到标准溶液和未知样品中，混匀并静置10分钟。 3、在每个试管中加入0.1ml Folin-Ciocalteu's酚试剂。在加入后马上彻底混合均匀。 4、在软件的定量模式的方法文件中，选择Lowry方法。 5、在定量标准模式，测量标准品2到5相对标准品1在725nm的吸光度。 6、在定量样品模式，测量未知样品(样品6)。 7、制作标准品吸光度相对浓度的曲线。 8、计算未知样品的浓度。 表1、蛋白标准品的浓度 Reagent Test Tube No. 1 2 3 4 5 6 1 mg/ml Standard Protein (ml) - 0.05 0.1 0.15 0.2 Unknown Protein (ml) - - - - 0.2 Saline Solution (ml) 0.2 0.15 0.1 0.5 - - Concentration (mg/dl) 0 25 50 75 100 - LAMBDA 465的仪器参数如下设置： 实验设置 数据类型：吸光度 采样：单池 模式：快速(光谱数：1/扫描数：50/积分数：1/增益数：1) 实验方法 图1、Lowry方法的谱图 图2、Lowry方法的校准曲线 结果 1、校准曲线 图1显示了蛋白标准溶液的光谱。它们在700-750nm范围有强吸收，测量725nm吸光度值。图2显示了得到的二阶(二次)校准曲线。曲线的相关系数R²是0.9995。 2、未知蛋白样品 未知样品的浓度计算结果为74.23mg/ml， 见表2. 表2、未知样品的计算浓度 Name Concentration (mg/dl) Au (725.00 nm) Unknown 74.23 0.9288 定量方法： Lowry方法 使用波长：725nm 曲线维度：2 使用LAMBDA 465 UV/Vis分光光度计和UV Lab软件，进行了蛋白的定量分析。光谱快速采集，并且灵敏度很高。UV Lab软件的定量模式有效的进行了数据处理和定量分析。 ( 1 . Ohnishi S T， Barr JK ： A simplified method of quantifyingproteins using the Biuret and phenol reagent. Anal Biochem 86： 193， 1978 ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：//www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs 版权所有 ◎2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@ 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。