单细胞中摄取含铂的癌症化疗化合物检测方案(等离子体质谱)

ICP-MS 单细胞分析方法介绍白皮书 引言 ICP-MS单颗粒分析技术(SP-ICP-MS))的出现和发展使得不同基体和应用中的金属颗粒的快速检测和分析成为可能，并因此开创了一个全新的研究领域1-6。SP-ICP-MS的特点是可以检测到带正电荷的离子产生的不连续的脉冲，并以微秒记的数据采集速率获得时间分辨信号。这种先进的数据采集能力使得开辟一系列新的研究领域成为可能。本文中，我们将介介ICP-MS单细胞分析技术((SC-ICP-MS) 的概念，这种技术可快速分析单个细胞中的金属含量。在介绍 SC-ICP-MS之前，让我们先来简单回顾下 SP-ICP-MS 的原理。 SP-ICP-MS：简单回顾 之前已有一些文献对 SP-ICP-MS 技术进行了全面的介绍7.8，此处仅做简要回顾。当纳米颗粒进入等离子体时被完全电离，产生的离子云可以被 ICP-MS 检测到。常规ICP-MS可以检测到连续信号，而 SP-ICP-MS 技术可检测到非连续的信号：一个纳米粒子产生一个脉冲峰，所得信号的强度与粒子的尺寸(nm)相关，脉冲数与颗粒浓度相关(颗粒/mL) SP-ICP-MS 的关键是快速，连续的测量，从而最大限度地减少同时检测到多个颗粒的机会，并确保没有遗漏待测颗粒。这些目标可以通过在 ICP-MS中采用快速电子元件， Lauren Amable Chady Stephan Stan Smith² Ruth Merrifield3 'National Institute on Minority Health andHealth Disparities， National Institute of Health，Bethesda，MD USA PerkinElmer Inc.， Shelton， CT USA 3Center for EnvironmentalNanoScience andRisk (CENR)，Arnold School of Public Health，University of South Carolina， SC USA 从而尽量消除四级杆的死时间来实现。这些特点对于准确分析非常重要：不连续的分析将丢失粒子信号，而过慢的进样时间或过长的进样时间窗口会导致在同一个数据采集窗口中得到多个粒子的信号。这两者都会导致不准确的粒子大小和计数结果。 另一个重要因素是样品中的颗粒浓度。随着颗粒浓度的增加，多个粒子同时离子化的概率也会增加。所产生的离子云将是由多个颗粒的离子组成的，无法代表单个颗粒的尺寸数据，所得结果中颗粒浓度将偏低，粒径会偏大。在高颗粒浓度的样品中，稀释是将多个颗粒同时进入等离子体的机会降至最低的有效方法。 将 SP-ICP-MS 应用于 SC-ICP-MS 用SP-ICP-MS相同的方式，将细胞悬浮液导入专用的SC-ICP-MS 进样系统进行雾化：细胞逐个进入等离子体，被电离，内部金属产生的离子云按照前面提到的数据采集方式被 ICP-MS 检测。在 SC-ICP-MS分析中，每个细胞被看做是一个单独的个体或粒子，可以产生自己的离子云。同 SP-ICP-MS 中一样，必须考虑细胞和待测离子浓度等条件，以获得最佳结果。理想的细胞浓度为大约100，000细胞/mL，以最大降低多个细胞同时同入 ICP-MS的可能性。在某些情况下，例如当介质中待测元素的离子浓度偏高，或者有纳米颗粒(NP)污染物，介质比较复杂等情况时，需将细胞从培养基中分离并重新分散于不含待测金属离子的新鲜介质或者等渗溶液中。这将有助于避免高浓度基体的背景干扰，防止单个细胞产生的信号被颗粒信号掩盖。 下面介绍几个 SC-ICP-MS的应用实例。 研究细胞摄取含铂的癌症化疗化合物 含铂(Pt)的化合物(即顺铂(SP-4-2)-二氨二氯铂(Ⅱ))是最常见的癌症化疗化合物。这些化合物的功效与其被细胞摄取的量有关，意味着摄取量的增加将实现更有效的癌症治疗。虽然 Pt对治疗许多癌症有效，但有些人会表现出抗药性，导致Pt的细胞摄取减少。因此，单个癌细胞的Pt含量可以预测治疗的有效性。 评估细胞顺铂吸收量的常规方法包括分离细胞群体，消解所有细胞，测量Pt含量。这种方法的局限性是比较耗时，并且假设所有细胞摄取顺铂的能力相同。 单个细胞的信息将提供准确的Pt含量和分布，细胞群中含有 Pt的细胞数量，这是了解细胞对顺铂治疗的耐药性的关键信息。所有这些信息都可以用 SC-ICP-MS获得，这些信息与单个细胞相关而不是大量细胞的平均浓度。 为了确定 SC-ICP-MS对顺铂检测的有效性，我们将卵巢癌细胞系(CP70)暴露于顺铂并进行监测。图1显示了暴露于顺铂的细胞中 195Pt同位素的 SC-ICP-MS 原始信号。因为 Pt不存在背景信号，并且195Pt 不受其他的元素干扰，所以每个脉冲就表示单个细胞中检测到的Pt。仅需一分钟的分析时间和50us的驻留时间，就可以采集到120万个数据点，如图1所示。从脉冲峰的大小的变化中可以得到我们需要的信息：不同细胞内Pt的含量不同，从而可以深入了解细胞的吸收机制，这些都取决于分子机制和细胞吸收与存储 Pt的能力。图2显示细胞 CP70 暴露于顺铂4小时后 Pt含量分布。 此外，我们研究了 SC-ICP-MS 监测 CP70卵巢癌细胞在8小时内摄取 Pt 的能力。图3显示，细胞内的Pt 含量随着时间增加，含量分布的右移，表明顺铂的吸收随着时间增长而增加。 图1.暴露于顺铂4个小时的卵巢癌细胞 SC-ICP-MS 的原始信号 图2. CP70 暴露于顺铂4小时后的Pt 含量分布 在不连续的两天重复测量平均 Pt含量与暴露时间的关系，结果表明 SC-ICP-MS具有非常好的精确度和重现性(图4)。我们可以将此项研究进一步拓展，探讨不同的细胞株在相似的实验条件下摄取顺铂的能力。 纳米材料的影响：研究细胞吸收 纳米颗粒被广泛应用于多个领域，从提高各种消费品的质量到助力癌症研究。同所有化学品一样，纳米颗粒释放到环境中也会带来潜在风险。像治疗传染病的传统疗法一样，银所具有的治愈功能使其在市场上被大量的添加在消费品中，从治疗脚气的袜子到防止儿童被细菌感染的动物玩偶填充物。但是，最新的研究结果表明纳米银对细胞具有毒性。最新的报告来自德国的马克斯普朗克研究所，其结论是一旦银纳米颗粒穿过细胞膜，他们将具有非常高的毒性。 关于环境和人类健康，有三个问题需要回答： 1.特定系统中有多少个纳米颗粒? (暴露) 2.这些纳米颗粒是否进入生物体，浓度是多少? (剂量)3.他们会产生什么效果? (响应) 图4.非连续的两天测量 CP 70 卵巢癌细胞在8小时内吸收顺铂的量，更高的强度表明细胞中有更多的顺铂 这些问题的答案有助于研发更具靶向性的药物，更充分地评估纳米颗粒的环境风险。前两个问题是关于单细胞生物如何与纳米颗粒相互作用的， SC-ICP-MS 可以提供快速简便的监测细胞吸收的手段，对回答这两个问题起到重要作用。基础研究包括将纳米颗粒添加进含有细胞的培养基中，然后使用 SC-ICP-MS 监测细胞吸收纳米颗粒的量。 图5是这种研究的一个实例，三种不同株的卵巢细胞暴露于两种不同浓度的金纳米颗粒中。洗涤细胞除去过量的纳米颗粒，然后在21小时后分析以确定细胞内的含量。图5中的数据显示不同的细胞株具有不同的纳米颗粒吸收率，某种程度上来讲，这与所研究的纳米颗粒的浓度相关。 图5.卵巢细胞在两种不同浓度的纳米颗粒中吸收纳米颗粒数据 测量单个细胞的金属含量 SC-ICP-MS 不但可用于研究细胞对金属的吸收行为，它也可以用于确定自然环境中细胞本身含有金属含量。在两种情况下，待测金属可以是存在于细胞培养溶液中并产生背景信号的元素。第一种情况，如果背景信号高，它可能掩盖来自细胞的金属信号。然而，使用SC-ICP-MS时，高的采样速率会将这种效应最小化。随着驻留时间减少(即采样速率增加)，背景信号减小，而信噪比保持恒定。因此，应选择最短的驻留时间来保证每个细胞的信号都能被检测到。第二种情况，当溶液中含有过高浓度的待测元素时，应采取适当的样品前处理方法。图6为测量单个 CP70卵巢癌细胞中的铜和锌的检测结果。 结论 本文介绍了使用SC-ICP-MS 快速检测单个细胞中金属的含量，为研究者开启了一个全新的研究领域。通过在细胞水平上监测细胞吸收顺铂的能力，我们探究了抗癌药物的有效性，加强了对细胞与含金属的物质之间交互作用的了解。SC-ICP-MS可以让用户检测单个细胞中本身含有的金属量以及离子或者纳米颗粒污染物，此方法可以减少实验中使用的细胞数量，并且无需复杂的样品前处理过程。 图6.卵巢癌细胞 CP70 中固有的铜和锌含量 ( 1 . Mit r ano， D.， Ranville， J.F ， Stephan， C. 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