酪氨酸酶中酶活性检测方案(紫外分光光度)

介绍 酶是生物催化剂。如果细胞中没有酶，大多数生化反应将不能以需要的速率进行。从19世纪早期就开始对酶的生理学和生物学性质进行研究。人们对酶持续的兴趣来源于几个因素-酶在细 胞中的动力学和基本角色，非凡的催化能力和选择性。本实验评估了动力学性质中的2个性质，即酶活性和分子选择性的动力学描述。 本应用报告以酪氨酸酶描述酶活性的测定。使用LAMBDATM465紫外/可见分光光度计和UV LabTM软件快速采集数据并进行处理。 原理 酪氨酸酶是含有铜的氧化还原酶，可以催化单酚的邻位羟基化和邻苯二酚的有氧氧化。通过监控3，4-二羟(基)苯丙氨酸(多巴)氧化为红色多巴色素，进行酶活性测定。 图1.酪氨酸酶催化酪氨酸和多巴氧化 酪氨酸酶性质 酪氨酸酶通常被称为多元酚氧化酶，具有双催化活性：单酚的o-羟基化和0-双酚的有氧氧化。 monophenol+02— → catechol+H，O 蘑菇酪氨酸酶为四聚体，分子量为128000，含有4个Cu+。酶中有2种底物结合部位，分别用于酚类底物和双氧结合位；因此，能与铜形成复合物的物质为酪氨酸酶活性的可能抑制剂。 酶活性单位 溶液中酶的量常以活性单位来表示。常用的活性单位有三种：国际单位(IU)，缩酮，比活性。国际酶生化委员会联合会推荐使用标准单位，国际单位或单位。在指定的PH、温度、离子强度和底物浓度下，1IU酶酶对应的量可以在1分钟催化1umol底物转变为产物。 其中， =摩尔吸收系数(M-1cm-1) V=比色皿中最终体积() A=吸光度 t=时间 (min， sec 等) 试剂和仪器 磷酸钠缓冲液， 0.1M， PH7.0 蘑菇中提取的酪氨酸酶(Sigma)， 5单位/ul于磷酸钠缓冲溶液中L-3，4-二羟(基)苯丙氨酸(L-多巴)， 2mg/ml于磷酸钠缓冲液中LAMBDA 465 紫外/可见分光光度计 UV Lab软件 比色皿(10mm光程) 过程 1. 准备0.1M磷酸钠缓冲液。 2.将酪氨酸酶和L-多巴溶解于0.1M磷酸钠缓冲液。 3.测定酪氨酸酶的量 3-1.按下表配制试剂 表1.酪氨酸酶测定一般过程，单位： ml Reagent 1 2 3 4 5 Phosphate buffer 1.995 1.990 1.980 1.960 1.940 L-Dopa 1 1 1 1 1 Tyrosinase 0.005 0.01 0.02 0.04 0.06 3-2.在475nm读取吸光度 3-3.被选酶的水平需覆盖的△A/min为0.025/min~0.25/min 4.计算酪氨酸酶浓度和酶活性因子 4-1.测定酪氨酸酶浓度 记录280nm下的吸光度(按结果部分计算酪氨酸酶浓度) 4-2.计算酶活性因子(见公式(I)) ：=3600M-1cm-1(产物多巴色素的摩尔吸收系数) Vf=0.003 L (比色皿中最终体积) 将这些值代入公式(I)，得到 单位=△A/At x0.83 因此，酪氨酸酶活性因子为0.83 5.仪器参数设置如下： 实验设置 数据类型： Absorbance 采样： 单池 模式： Faster ( Spectra No： 1， Scan No.：10， Integration No： 1， Gain No： 1) 实验类型： 酶活性 图2.测定酪氨酸酶活性的实验设置 6.测定最终样品溶液的A475。 结果 1.计算酪氨酸酶浓度 酪氨酸酶的吸收系数E2801%是24.9。即，1% (w/v) 酪氨酸酶在1cm比色皿中280nm下的吸收尾24.9。 Beer's定律：A=Elc 因此，从比值可以计算酪胺酸酶浓度 式中， C1=标准酪氨酸酶溶液浓度，即1% A2=未知浓度酪氨酸溶液在280nm的吸收，0.045因此， X=0.0018%(w/v) 将浓度转化为mg/ml并乘以稀释因子(最终体积/样品体积)，酪氨酸酶浓度=0.18 mg/ml。 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 ( 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号 ) 2.测定酪胺酸酶活性(见图3，表2，表3) 图3.每分钟A475的变化 表2.每30秒测定的吸收值 Time (Min) 475.000 nm 0 0.1091 0.5 0.219 1 0.3186 1.5 0.4106 2 0.4956 2.5 0.5724 3 0.6451 表3.人血清中的酚类底物水平 Name Start End Rate Activity Activity (Min) (Min) (Au/Min) Factor (umol/min) Tyrosinase 0 3 0.1780 0.8300 0.1477 3.比活性 酪氨酸酶的比活性为82单位/mg 结论 使用LAMBDA465紫外/可见分光光度计和UV Lab软件测定了酪氨酸酶活性。谱图测定快速，灵敏度良好，软件能有效定量和处理数据。 ( 1. Maniatis， F.L.， Firitsch ， E .F . ，Sambrook， J.，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual， Cold Spring H arbor Press， New York， 1982. ) 2. Rodney Boyer， Modern Experimental Biochemistry， 3rd ed.：Benjamin/Cummings，2000. ( 版权所有 ◎2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@ 是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 ) 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUsCHN_