DNA中热变性检测方案(紫外分光光度)

版权所有 ◎2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。012401_CHN_01 介绍 热变性研究可以提供大量的有关DNA 分子二级结构的信息。双螺旋结构由碱基对腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T) 和鸟嘌呤-胞嘧 (G-C) 的氢键连接在一起。由于 G-C碱基对有3个氢键，而A-T碱基对有 2个氢键，含有更多G-C成分的DNA样品就需要更多的能量打开螺旋，形成更高的DNA融化温度。当DNA样品加热时， UV/Vis分光光度法可用来监测DNA的热变性过程，从而判断DNA的融化温度tm，并最终确定分子的G-C成分含量。 DNA有特征的UV/Vis光谱，在260nm有吸收峰，如图1所示。 图1、DNA样品的UV/Vis光谱 在样品的热变性过程中，这个吸收峰的强度会显著增加到一个最大值。监控变性过程中这个峰的强度变化，可得到DNA融化曲线，进而可以确定真实的融化温度以及计算G-C成分的含量。计算公式如下： 这里，M是溶液的摩尔浓度， mol/L K是DNA碱基对长度(当样品含有超过500碱基对时，K的影响可忽略) 含有给定数量碱基对的给定DNA类型的溶液，在相同的pH和离子强度条件下，会显示相同的融化温度。但是，这些条件改变，会对融化温度产生非常大的影响。例如，改变溶液的离子强度， 从0.0165M改为0.06M， 融化温度将大约提高10℃。 使用Calf Thymus DNA (Sigma D4522)样品进行热变性实验。该样品最终在0.06M氯化钠/酒石酸钠缓冲液中被稀释到最终浓度为40ug/mL。实验具体信息如图2所示。 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999 图2、DNA融化实验的方法 LAMBDA 365的单池帕尔贴池架被用来精确控制实验的温度。使用缓冲液作为空白，样品在10mm光程的比色皿中进行测试。以2℃的步进温度将溶液的温度从40℃升高到90℃， 同时测量样品260nm的吸光度。获得的融化曲线如图3所示。 图3.Calf Thymus DNA的融化曲线 使用1阶导数方法，计算tm，结果为78℃。G-C成分的含量依据以下公式计算： %G-C=2.44x(tm-81.5-16.6 (log (M))+500/K) 可得到结果为41.8%，同报告值42%非常接近。 总结 LAMBDA 365 UV/Vis分光光度计功能强大，既可以进行光谱扫描，也可以单波长测量，可进行各种生物应用分析。本例中，我们演示了仪器和UV Express软件进行Calf Thymus DNA的融化曲线测量、计算融化温度和G-C成分含量的能力。 www.perkinelmer.com.cn PerkinElmer 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：//www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs