植物提取物中氨基酸分析检测方案(制备液相色谱)

Agela Technologies博纳艾杰尔产品应用案例 植物提取物中氨基酸的分析报告 AP10068应用及技术服务部 摘要：本实验采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生剂，同时采用反向高效液相色谱法，，以正亮氨酸为内标物，使用Venusil@AA氨基酸分析方法包，分析某植物提取物中氨基酸的组成。 关键词：高效液相色谱法；异硫氰酸苯酯(PITC)；植物提取物；：Venusil@ AA色谱柱 前言 氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。 本实验采用Venusil@AA氨基酸分析方法包中的检测标准，使用Venusil@AA氨基酸分析专用柱对某植物提取物中的氨基酸组成进行了测试。 实验部分 仪器、试剂与材料 试剂材料 流动相A：称取15.2g无水醋酸钠，加水1850 mL 溶解，用冰醋酸调节 pH至6.5，然后加入乙腈140 mL，混匀； 流动相B：：乙乙：水=80：20； 水解液：6.0 mol/L 盐酸溶液(含1%苯酚)； 稀盐酸：0.1 mol/L盐酸； 内标溶液：称取正亮氨酸10 mg， 置于 10 mL 容量瓶中，加稀盐酸溶解并定容至刻度； 三乙胺乙腈溶液：取 Venusil@ AA 氨基酸分析方法包中三乙胺一瓶，加乙腈8.6mL， ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 混匀； 异硫氰酸苯酯乙腈溶腈：取 Venusil@ AA 氨基酸分析方法包中异硫氰酸苯酯溶液1瓶，加乙腈2.0mL，混匀； 氨基酸标准溶液：取Venusil@AA 氨基酸分析方法包中17种氨基酸标准溶液(包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、赖氨酸)1.0 mL，稀盐酸4.0mL稀释，混匀； 某植物提取物样品：黄色粉末，由某药业有限公司提供。 样品水解 分别称取某植物提取物A、B、C各1.0 g，分别置于10.0mL水解管中，加 0.1 mol/L稀盐酸 9.0 mL 溶解，振摇使样品均匀分散于溶液中。将水解管置110±1℃烘箱中水解24小时。取出水解管，冷却至室温，移取水解液1.0mL， 置于10 mL 样品瓶中，放入氮吹仪中以50℃氮吹至干，向残渣中加入 0.1 mol/L 盐酸1.0 mL， 超声使充分溶解，用0.45 um 滤膜过滤后，供衍生使用。 氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生 取17种氨基酸标准溶液、上述氨基酸水解液样品溶液各200 uL，分别置于1.5 mL离心管中，向每个离心管中加入内标溶液 20uL， 混匀，然后依次向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100 pL， 异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 uL， 混匀，室温放置1小时。再向每个离心管中加入400 pL 正己烷，振摇后放置 10 min，取下层溶液200 uL， 加 800 uL水稀释，经0.45 um 针筒过滤器过滤，取续滤液作为样品试液。 色谱条件 色谱柱：Venusil@ AA； 5um； 4.6×250mm； 流速11.0mL/min：柱 温 ：40℃： 波 长：：：254nm： 进样量： 10uL； 梯 度： 表1.液相色谱梯度洗脱条件 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 博纳艾杰尔产品应用案例 时间/min A/% B/% 0 100 0 2 100 0 15 90 10 25 70 30 33 55 45 33.1 0 100 38 0 100 38.1 100 0 45 100 0 结果与讨论 本实验采用 Venusil@ AA 氨基酸分析方法包对某植物提取物中氨基酸进行了测试，由表2及图2、3、4可知，使用 Venusil@ AA 氨基酸分析方法包共检测出某植物提取物中 17种氨基酸。 表2.某植物提取物中氨基酸含量测试结果 色谱峰序号 氨基酸名称 氨基酸含量mg/g 某植物提取物A样 某植物提取物B样 某植物提取物C样 1 门冬氨酸 0.0067 0.0104 0.0080 2 谷氨酸 0.0614 0.0662 0.0569 3 丝氨酸 0.0072 0.0071 0.0034 4 甘氨酸 0.0022 0.0036 0.0025 5 组氨酸 0.0154 0.0093 0.0052 6 精氨酸 0.0152 0.0085 0.0157 7 苏氨酸 0.0032 0.0036 0.0023 8 丙氨酸 0.0124 0.0123 0.0065 9 脯氨酸 0.0099 0.0088 0.0058 10 酪氨酸 0.0019 0.0024 0.0016 11 缬氨酸 0.0051 0.0056 0.0038 12 蛋氨酸 0.0021 0.0029 0.0020 13 胱氨酸 0.0004 0.0005 0.0003 14 异亮氨酸 0.0087 0.0087 0.0078 ( 地址： 天 津经济开发区西区南大街179号 邮编：300462 ) ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 博纳艾杰尔产品应用案例 15 亮氨酸 0.0059 0.0060 0.0046 16 苯丙氨酸 0.0017 0.0030 0.0018 17 赖氨酸 0.0006 0.0010 0.0007 总计 0.1600 0.1599 0.1289 WD1A\Vavel engt h=254 nm(贾超斌\VENUSIL-AA20141015 2014-10-1514-24-41\001-0102.D) 图1.18种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图 图2.某植物提取物A 水解液高效液相色谱图 图2.某植物提取物B水解液高效液相色谱图 ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 图2.某植物提取物C 水解液高效液相色谱图 结论 根据实验结果，使用 Venusil@AA氨基酸分析方法包共检测出某植物提取物中 17种氨基酸， A、B、C样品中氨基酸总量分别为 0.1600 mg/g、0.1599 mg/g、0.1289 mg/g。 附：相关产品 产品名称 规格描述 包装数量 订货号 Venusil@AA 氨基酸分 1 AA952505-K 析方法包 Venusil@AA 氨基酸分析专用柱 4.6×250 mm， 5 um 1 AA952505-0 异硫氰酸苯法(PITC) 25 uL 10 AA-D 氨基酸标准溶液(含17种氨基酸) 1mL 2 AA-S 正亮氨酸(Nle) 100 mg 1 AA-I 三乙胺(TEA) 1.4mL 2 AA-B 1.5 mL样品瓶 短螺纹透明带书写处32×11.6mm 100/PK 1109-0519 1.5 mL样品瓶盖 9mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色 PTFE 隔垫 45°Shore A； 1.0 mm 100/PK 0915-1819 散孔滤膜 单膜，13mm， 0.45 um 100个/包 AS021345-T -次性注射器 2mL无针头 100支/包 LZSQ-2ML 乙腈 4L/瓶，色谱纯 4x4L/箱 AH015-4 ( 电话：022-25321032 传真：022-25321033 ) ( Email： s e r vi c e@ag e l a .co m. cn 网址： w w w .ag e la.co m . c n 客服：400-606-8099 ) 地址：天津经济开发区西区南大街 邮编：话： 传真：