小鼠血浆中人参皂苷Rg1、Re、Rb11检测方案(液相色谱柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923Vol.28 No. 5Oct. 2007第28卷 第5期2007年10月暨南大学学报(自然科学版)Journal of Jinan University(Natural Science) 北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923第28卷492暨南大学学报(自然科学版) = =卡 二 HPLC/MS/MS 法同时测定小鼠血浆中人参皂苷Rg、Re、Rb， 洪爱华，陆大祥，，，戚仁斌²， 尹平河，?李国强 (暨南大学1.实验技术中心；2.医学院病理生理教研室，广东广州510632) [摘 要] 利用高效液相色谱-串联质谱联用的技术，建立同时测定小鼠血浆中的人参皂苷 Rg、Re、Rb， 浓度的分析方法.以 RESTEK Pinnacle ⅡCg柱(50 mm×2.1 mm，5 um)为色谱柱，流动相：乙腈-水(梯度洗脱)；流速200uL·min-；柱温：20℃；质谱条件为气辅辅助电喷雾离子源(ESI)，检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的离子为 m/z Rg 832.8-643.6；Re 969.8-789.7；Rb，1132.1→365.3；生物样品采用固相萃取方法处理人参皂参Rg、Re、Rb，标准曲线的线性范围为0.5~1000 ng· mL"，最低定量下限达到0.5 ngmL"，日内、日间变异系数(RSD)均<15%，精密度和准确度等均符合生物样品分析的要求.结果表明该法准确、灵敏、特异，适用于血浆中人参皂苷Rg、Re、Rb，浓度的同时测定. [关键词] 高效液相色谱-串联质谱联用； 人参皂苷 Rgi、Re、Rb； 浓度测定 [中图分类号] 0652.9 [文献标识码] A [文章编号] 1000-9965(2007)05-0491-03 Simultaneous determination of ginsenosides Rg，Re andRb， in mouse plasma by HPLC/MS/MS HONG Ai-hua'， LU Da-xiang’， QI Ren-bin’， YIN Ping-he， LI Guo-qiang’ (1. Experiment and Technology Center， 2. Department of Pathphysiology，Medical College， Jinan University， Guangzhou 510632， China) [Abstract]‘The aim of this research is to establish a HPLC/MS/MS method for simultaneous determi-nation of ginsenosides Rg，Re and Rb， in mouse plasma. RESTEK Pinnacle I Cig column(50 mm×2. 1mm，5 u.m) was used with a mobile phase of acetonitrile-water (gradient elution). The column tempera-ture was 20 ℃. Gas auxiliary electrospray ionization source(ESI) was used to detected the ginsenosidesRg，Re and Rb， by the positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring mode(MRM m/z Rg 832.8→643.6；Re 969.8-+789.7；Rb，1132.1→365.3). The plasma samples were extracted withsolid phase extraction. The calibration curves of ginsenosides Rg，Re and Rb， in plasma were linear inthe range of 0.5 to 1 000 ngmL-， and the limit of quantitation was 0.5 ng mL. The within-dayand between-day RSDs were less than 15%. The results show that this method established in the presentresearch is accurate， sensitive， and specific， and then is suitable for simultaneous determination of gin-senosides Rg，Re and Rb， in mouse plasma. Key words HPLC/MS/MS： ginsenosides RgRe and Rb；determination ( [收稿日期] 2007-06-15 ) ( [基金项目] 教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20060559003) ) ( [作者简介] 洪爱华(1977-)，女，实验师，硕币，研究方向：仪器分析与应用. Email： hah _ angel@163. com ) 人参皂皂 Rg、Re、Rb，是人参的代表性成分，代表人参的部分药效，用液相色谱检测中药复方中人参皂苷 Rg：、Re、Rb，其灵敏度和专属性较差，难以满足药代动力学检测的要求1-3].本文建立了一种专属、灵敏、准确，操作简便的高效液相色谱-串联质谱联用方法，用于血浆中3种人参皂苷Rg、Re、Rb浓度的同时测定. 1 实验部分 1.1 仪器、试剂与材料 美国 AB公司 ABI4000 Q TRAP 三级四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)；美国 Agilent 公司1100液相色谱系统；美国 Waters 固相萃取仪， Wa-ters Oasis HLB 柱. 人参皂苷Rg、Re、Rb，对照品：暨南大学医学院病理生理教研室提供(购自中国药品生物制品检定所，批号分别为110703-200424、110754-200421、110704-200420).乙腈为色谱纯，美国 TE-DIA 公司产品；水为超纯水(蒸馏水再经过 Millipore超纯水系统制备).小鼠血浆由暨南大学医学院病理生理教研室提供. 1.2 分析条件 色谱条件：色谱柱为 RESTEK Pinnacle I Cig柱(50mm×2.1 mm，5 um)；柱温：20℃；流速为200u.L·min；流动相为A水(体积分数0.5%o甲酸)，B乙腈(体积分数0.5%0甲酸)，梯度洗脱(0~13min，流动相B体积分数20%~50%；13~13.1min，流动相B体积分数50%~20%；13.1~23min，流动相B体积分数20%). 质谱条件：电喷雾 ESI 离子源；气帘气为 10psi；雾化气(GAS1)为 40psi；加热辅助气(GAS2)为40psi；碰撞气 CAD 为 Medium；喷雾电压 IS 为5 500V；雾化温度为500℃；检测方式为正离子多离子反应检测(MRM)，用于定量分析的离子离 m/z Rg832.8→643.6；Re 969.8→789.7； Rb，1132.1→365.3. 1.3 血样处理方法1-2.4] 用 Waters 固相萃取仪，Waters Oasis HLB 主依次用甲醇和水各2mL活化，取血浆0.5mL减压恒速通过 SPE 柱，然后用水2 mL 清洗小柱，抽干，最后用甲醇2 mL洗脱，收集洗脱液，35℃水浴氮气流 下吹干，残留物用流动相 500 u.L充分溶解后，过0.45 pm 滤膜，取5 pL进样，进行 HPLC/MS/MS分析. 2 结果与讨论 2.1 分析方法的建立 3 种皂苷一级质谱丰度最高的离子峰是[M+Na]*，有少量[M+H]+和[M+K]*，子离子扫描质谱图见图1~3，检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的离子为m/z Rg， 832.8一643.6；Re 969.8→789.7；Rb，1 132.1→365.3，定性分析的离子为m/z Rg，832.8-203.2；Re 969.8→203.2；Rb，1 132.1→789.7；所用的色谱条件使得被分析化合物在5~12 min 内被洗脱出来(图4)，人参皂苷Rg：、Re、Rb，的保留时间分别约为6.1、6.5和11.3 min，以保留时间和各对离子的响应强度的比例作为定性分析标准，使方法的专属性更强，有效避免了血浆内源性物质对3种皂苷测定的的扰. 图1 人参皂苷Rg， 的子离子扫描质谱图 图2 人参皂苷 Re的子离子扫描质谱图 2.2 标准曲线 取空白血浆0.5 mL，加入人参皂苷Rg，、Re、Rb对照溶液，配制成终质量浓度为0.5、2、5、10、50、100、1 000 ng·mL"系列标准血浆样品，按“1.3”血样处理方法处理后，进样分析，以测得的峰面积对血 药浓度X作直线回归，线性关系良好，标准曲线回归方程分别为：RgY=2 320X-18 900，r=0.999 8；Re Y=2330X-21700，r=0.999 5；Rb， Y=455X-4 570，r=0.999 2；定量下限达到0.5 ngmL-. 图3 人参皂苷 Rb，的子离子扫描质谱图 图4 多离子反应监测(MRM)扫描模式下人参皂苷Rg、Re、Rb， 的色谱图 2.3 精密度和回收率 取空白血浆 0.5 mL，配制低中高3个质量浓度(5、50、1000 ngmL-')质控样品，按血样处理方法进行处理.每个质量浓度5份样品同日测定，得日内精密度；每个浓度5份样品分别于5日内测定，得日间精密度；将质控样品测得的色谱峰面积与空白血浆提取后加入标准品溶液后进样测得的峰面积相比，考察方法的相对回收率，结果见表1.本方法的精密度和回收率的偏差均<15%，符合生物样品分析要求2. 2.4 稳定性 血浆样品中人参皂苷Rg，Re、Rb经3次反复冻融和-20℃保存7d仍保持稳定；常温下放置至少12h 后保保持稳定.其稳定性可以满足测定方法的要求. 表1 测定血浆中人参皂苷 Rg、Re、Rb，的精密度和回收率” 人参皂苷 p/(ng· 日内相对标准日间相对标准 相对回 mL-1) 偏差/% 偏差/% 收率/% 5 4.4 12.5 84.3±3.7 Rg 50 5.0 14.3 81.1±4.0 1000 5.5 9.3 83.6±5.2 Re 5 5.1 8.5 70.7±3.6 50 4.6 13.8 72.1±3.3 1000 5.3 7.6 84.7±4.5 Rb， 5 9.9 13.3 88.5±6.8 50 7.6 8.9 76.0±5.8 1 000 4.2 14.1 85.9±3.6 1)n=5， mean±SD 中药药代动力学研究大多存在成分复杂和待测成分血药浓度低的难题，人参皂苷 Rg，、Re、Rb，在紫外区 203 nm 有末端吸收，但其紫外响应较低，而且血浆中杂质的紫外末端吸收较多，采用普通的HPLC 紫外检测器难以进行高灵敏度的检测且专属性较差.本文建立的 HPLC/MS/MS方法灵敏高，结果准确，重现性好，操作简便快速，符合生物样品分析的要求，可用于3种人参皂苷 Rg，、Re、Rb，的体内定量分析，为客观的评价这3种人参皂苷在人体或动物体内的药动学规律提供方法学参考. ( [参考文献] ) ( [1] 杨 柳，刘奕明，曾 星，等. HPLC/MS/MS法测定 参麦注射液及人血浆中的人参皂苷 Rg1[J]. 药物分 析杂志，2005，25(8)：905-908. ) ( [2] 刘奕明，杨 柳，曾 星，等.液相色谱-质谱联用法测定人参皂苷Re在健康人血浆的浓度[J].中国临床 药理学杂志，2005，21(5)：381-383. ) ( [3] 沈志滨，朱俊访，李 博，等.HPLC-MS 法测定益气 复方口服液中人参皂苷RgRe、Rb，的含量[J].广东 药学院学报，2006，22(3)：259-260. ) ( [4] 茅向军，孙建国，吕 天， 等.HPLC-MS 法测定犬血 浆中三七皂苷R，的血药浓度及其药代动力学[J].中国临床药理学与治疗学，2005，10(7)：734-737. ) ( [责任编辑：黄建军] ) www. yuweichina.com. 邮箱water com 利用高效液相色谱一串联质谱联用的技术，建立同时测定小鼠血浆中的人参皂苷Rg。、Re、弛。浓度的分析方法．以RESTEK PinnacleⅡCls柱(50 toni×2．1 toni，5岬)为色谱柱，流动相：乙腈一水(梯度洗脱)；流速200pL·rain～；柱温：20℃；质谱条件为气动辅助电喷雾离子源(ESI)，检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的离子为m／z RSI 832．8—“3．6；Re 969．8—玎89．7；Rb。1132．1—365．3；生物样品采用固相萃取方法处理．人参皂苷Rgl、Re、Rh标准曲线的线性范围为0．5—1 000 ng·mL～，最低定量下限达到0．5 tag·mL～。13内、日间变异系数(RSD)均<15％，精密度和准确度等均符合生物样品分析的要求．结果表明该法准确、灵敏、特异，适用于血浆中人参皂苷Rg。、Re、Rb，浓度的同时测定．