人血浆中头孢克洛检测方案(液相色谱柱)

北京维科技有限公司联系人：水先生电话：189118499232008，23(2)：207~209 北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：120818911849923第23卷华西药学杂志 LC -MS/MS测定人血浆中的头孢克洛 赵曦'，杨汉煜'，张彦玲1，李俊德 (1.石药集团药物研究院药理中心，河北石家庄050051；2.石家庄四药有限公司，河北石家庄050051) 摘要：目的 采用LC-MS/MS测定人血浆中的头孢克洛。方法 血浆样品经沉淀蛋白处理后，用 Allure C柱(50 mm×4.6mm，5 pm)分离，乙腈-1%甲酸(20∶80)为流动相；采用三重四串杆串联质谱，电喷雾离子源，以正离子多反应监测方式进行定量分析。结果 血浆中头孢克洛的线性范围为0.01~10.00 pgml，定量下限为 0.01 ugml"'。回收率为79.6%~83.2%，日内、日间 RSD 均小于3.5%。结论 所建方法专属、灵敏、准确，适用于头孢克洛药物动力学的研究。 关键词：头孢克洛；液相色谱-串联质谱法；血药浓度；血浆样品 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1006-0103(2008)02-0207-03 Determination of Cefaclor in human plasma by LC-MS/MS ZHAO Xi，YANG Han-yu'，ZHANG Yan -ling'，LI Jun -de (1. Pharmaco-center of Pharmaceutical Research Institute，Shijiazhuang 050051， China；2. Shijiazhuang No. 4 Pharmacopedia Ltd.，Shijiazhuang 050051，China) Abstract： OBJECTIVETo establish an LC/MS/MS method to determine Cefaclor in human plasma. METHODS Plasma sam-ples were preciptated with methanol intially，then the separation was performed on a Allure Cg analytical column using acetonitrile-1%formic acid (20： 80) as the flow rate at 0.5 ml·min". Electrospray ionization source (ESI) was applied and operated in positive ionmode for the quantitive analysis by MRM. RESULTS LLOQ of Cefaclor was 0.01 pgml-. The linear range of Cefaclor was 0.01-10.0 ugml. The mean recovery was 79.6%-83.2% with intra- day and inter - day RSD less than 3.5%. CONCLUSIONThemethod is proved to be specific， sensitive and accurate， and suitable for clinical pharmacokinetics study of Cefaclor. Key words： Cefaclor；LC-MS/MS；Plasma concentration；Plasma sample CLC number： R917 Document code：A Article ID：1006-0103(2008)02-0207-03 头孢克洛为第二代头孢菌素，因抑制细菌细胞壁的合成导致细胞溶解而发挥杀菌作用11，2]。目前，多采用 HPLC 法检测其人体内的血药浓度，但灵敏度较低，很难检测到3.5 h 后的血药浓度。而采用LC - MS/MS 法测定时，样品的前处理方法烦琐1.2]。为此，特建立了简便的头孢克洛血浆样品前处理过程和专属、灵敏、快速的 LC-MS/MS测定方法，并用于分析临床药物动力学样品。 实验部分 1.1 仪器与试药 API 4000 型液相色谱-三重四级杆质谱联用仪包括 Analyst 1.4 软件(美国ABI 公司)；1100色谱系统(美国安捷伦公司)。希刻劳干混悬剂(礼来苏州制药有限公司)；头孢克洛对照品(中国药品生物制品检定所，批号：130481-200503，93.7%)；匹多莫德内标(河北省药品检验所，批号：010626，含量99.1%)；乙腈、甲酸为色谱纯；空白人血浆(河北省中心血站)；受试血浆样品(中国人民解放军白求 恩和平医院国家药品临床研究基地)在采血后迅速分离提取血浆样品，并立即在受试血浆中加入5%冰醋酸，使血浆样品 pH <4.5。 1.2 方法与结果 1.2.1 LC - MS/MS 的条件 色谱谱采用 AllureCg柱(50 mm × 4.6 mm，5 um)；流动相为乙腈-1%甲酸水溶液(20：80)；流速0.5 ml·min；进量10 pl；柱温20℃。质谱条件采用电喷雾离子化源(ESI)；电离电压为5.5 kV；卷帘气、雾化气、辅助气和碰撞气均为N，流量分别为25、60、40、8L·min"；毛细管雾化温度为500℃；正离子方式检测；扫描方式为多离子反应监测(MRM)。用于定量分析的离子反应分别为 m/z 368.0、174.1(头孢克洛)，m/z 245.2、134.0(内标，匹多莫德)，驻留时间均为200 ms。 1.2.2 溶液的制备 精密称取 26.68 mg 头孢克洛对照品，置25ml量瓶中，用5%冰醋酸液配成1.0mg'ml"的对照品贮备液；含含5%冰醋酸的空白血浆稀释该贮备液为0.01、0.02、0.05、0.20、0.75、 ( 作者简介：赵曦(1979-)，男，云南宜良，硕士，工程师，从事药物动力学研究工作。 ) ( *通讯作者( Correspondent author)，E-mail：zxyyy.678@ tom. com ) 2.50、10.00 pg'ml"的系列对照品溶液。精密称取25 mg匹多莫德，置25 ml量瓶中，用甲醇配制成1mgml"的贮备液，用含1%甲酸的甲醇液稀释成1wgml"的内标液。 1.2.3 血浆样品的处理 精密吸取0.1 ml血浆样品，置2 ml离心管中，加入0.1 ml 内标溶液，精密加入0.2ml含1%甲酸的甲醇溶液，漩涡混合0.5min，1×10*r·min'离心5 min；取0.1 ml上清液，置2ml离心管中，加加0.4 ml 1%甲酸的水溶液，漩涡混合0.5 min，取 10 ul进行分析。 1.2.4 质谱分析采用正离子方式检测，在一级全扫描质谱中，基峰均为质子化的准分子离子峰[M+H]*，m/z为368、245)，选择性对[M+H]*峰进行二级质谱分析(图1)，选择主要的碎片离子(m/z为174、134)作为MRM定量分析的产物离子。 图1 头孢克洛(A)和匹多莫德(B)的产物离子全扫描质谱图 Fig 1 Production mass spectra of Cefaclor(A)and Pidotimod(B) 1.2.5 方法的专属性 分别取6名受试者的空白血浆0.1 ml，其中不加内内标液(用1%甲酸的甲醇液0.1 ml 补齐)，其余按“1.2.3”项下方法操作，进样10pl；取对照品溶液0.1ml，按“1.2.3”项下方法操作，头孢克洛和内标的保留时间约为1.5、1.4min；取健康受试者给药后收集的血浆样品，同法操作。结果表明，样品中内源性物质不干扰头孢克洛和内标的测定。 1.2.6 标准曲线和定量下限 分别取头孢克洛系列对照品血浆溶液各0.1ml，按“1.2.3”项下方法操作，进样10 pl，记录色谱图；以浓度(pgml"')为横坐标、头孢克洛与内标峰面积比为纵坐标，采用加权(1/C)最小二乘法进行回归，回归方程为：A=0.764C+0. 001(r=0.9995)。血浆中头孢克洛0.01~10.00 ugml"与峰面积比呈良好的线性关系，定量下限为0.01 ugml。 1.2.7 精密度和准确度试验 按“1.2.6”项下方法配制头孢克洛低、中、高浓度(0.02、0.75、8.00 pgml")的血浆样品溶液，分别取上述血浆溶液0.1ml，每个浓度6份，连续测定4批，并与标准曲线同时进行。采用单因素方差分析法求得本法的精 密度与准确度，结果日内、日间 RSD 均小于4.0%(表1)。 表1 血浆中头孢克洛测定方法的精密度与准确度 Table 1Precision and accuracy of the determination of cefaclor inhuman plasma Added/ Found/ Intra - day Inter -day Relative pgml ug'ml RSD/% RSD/% error/% 0.02 0.02 3.71 3.46 -1.0 0.75 0.74 1，76 2.06 -1.2 8.0 8.21 3.46 1.62 2.6 1.2.8 回收率试验 分别取“1.2.7”项下的血浆样品溶液0.1 ml，每个浓度6份，按“1.2.3”项下方法操作，记录头孢克洛的峰面积A，。另取上述3个浓度的5%冰醋酸水溶液 0.1 ml，其余按“1.2.3”项下方法操作，记录头孢克洛的峰面积Ai。按“回收率=A，/A×100%”计算，低、中、高浓度血浆中，头孢克洛提取回收率分别为83.2%79.6%、81.2%。内标溶液同法处理，回收率为77.3%。结果表明，方法存在一定的基质效应，但头孢克洛与内标的提取回收率均比较稳定，不影响血浆中头孢克洛的测定。 1.2.9 稳定性考察 考察样品在血浆中室温放置4h的稳定性；处理后的样品在1%甲酸溶液中室温放置24h内的稳定性；血浆样品反复冻融3次及在-20℃冷冻保存7d内的稳定性，其 RSD 均<5.9%。1.2.10 方法学应用 图2为20名受试者单剂量口服250mg头孢克洛(希刻劳)后的药-时曲线。按文献1~3)报道的线性范围试验，发现部分血浆样品的药物浓度超出其上限，对超限的血浆样品进行复检。即将超限血浆样品用含5%冰醋酸的空白血浆稀释1倍后，按“1.2.3”项下方法操作；复检结果与原测定结果比较偏差均小于15%，故超限样品的血药浓度均采用复检结果。 图220名受试者单剂量口服250 mg 头孢克洛后的药一时曲线 Fig 2Mean plasma concentration -time curve of Cefaclor after asingle administration of 250 mg Cefaclor to 20 volunteers 2 讨论 头孢克洛通常在血浆样品中易降解，在pH<4.5的环境中较稳定。因此，往血浆样品中加加5% 冰醋酸、用1%甲酸的甲醇溶液沉淀蛋白等操作来保持头孢克洛的稳定。文献报道的流动相为甲醇-1%甲酸(80：20)，操作时发现头孢克洛出现明显的溶剂效应(色谱峰为双峰)和极严重的质谱离子抑制现象。将流动相变为乙腈-1%甲酸(20：80)，通过降低有机相比例，增加了头孢克洛的色谱保留，使色谱峰形和基质效应明显改善。采用乙腈代替甲醇后，质谱响应提高近3倍且响应较稳定。文中用1%甲酸的甲醇溶液沉淀血浆蛋白，上清夜再用1%甲酸水溶液稀释后直接进样分析，采用 LC-MS/MS 方法分析血浆样品，每个样品所需分析时间仅为2 min。方法灵敏、快速、简便，适用于头孢克洛临床药物动力学的研究。 ( 参考文献： ) ( [1] 张静，李健华，赵悦，等. HPLC 法测定人血浆中头孢克洛浓度[J].江苏药学与临床研究，2002，10(3)：11-13. ) ( 2] Chen XY，Zhong DF ， Huang B，et al. Determination of cefaclor in human plasma by a sensitive and specific liquid chromatographic - tandem m ass s pectrometric method J1. J Chromatoer B， 2003， 784：17-24. ) ( [3] 赵明，张逸凡，钟大放，等.头孢克洛缓释片在健康人体的药代动力学和生物等效性[J].中国临床药理学杂志，2003，19 (6)：426-429. ) ( [4] Causon R. Validation o f chromatographic methods i n biomedical analysis--Viewpoint and discussion[J]. J C hroma B， 1997，689： 175-178. ) HPLC - ELSD 测定芪红胶囊中的黄芪甲苷 宋晓东，刘 哲，辛颖，张禅那，惠汝太 (中国协和医科大学阜外心血管病医院教育部心血管病基因与临床研究重点实验室中德实验室，北京100037) 摘要：目的 采用 HPLC-ELSD法测定芪红胶囊中的黄芪甲苷。方法 采用 Capcell PAK C色谱柱(250 mmx4.6 mm，5 pm)，流动相为甲醇-水(75：25)，检测温度115℃，载气流速 2.5 ml·min，柱温35℃。结果 黄芪甲苷能与相邻峰完全分开，进样量1.012~5.06 pg与峰面积积分值的线性关系良好(r=0.9998)。结论 所建方法简便易行，准确可靠，可用于芪.红胶囊中黄芪甲苷的质量控制。 关键词：芪红胶囊；黄芪甲苷；高效液相色谱-蒸发光散射检测 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1006-0103(2008)02-0209-02 Determination of astragaloside Ⅳ in Qihong capsule by HPLC -ELSD SONG Xiao -dong， LIU Zhe， XIN Ying， ZHANG Chan - na， HUI Ru - tai (Key Laboratory of Clinical Cardiovascular Genetics， Ministry of Education & Sino - German Laboratory for Molecular Medicine， Cardio-vascular Institute & Fuwai Hospital， Peking Union Medical College，Beijing 100037， China) Abstract：OBJECTIVE To establish an HPLC - ELSD method for the determination of astragaloside Ⅳ in Qihong capsule.METHODSThe HPLC system was consisted of Capcell PAK Cs column(250 mmx4.6 mm， 5 pm)，a mixture of methanol and water(75 ：25)as the mobile phase.The detector temperature at 115℃，the flow rate was 2.5 ml·minand the column temperature wasset at 35℃. RESULTSs The peak of astragaloside Ⅳ could be separated from others completely， and the linear range of astragalosideⅣ was 1.012-5.06 pg(r=0.9998). CONCLUSIONTThe established method is simple， accurate and suitable for the determina-tion ofastragaloside Ⅳ in Qihong capsule Key words：Qihong capsule； Astragaloside Ⅳ； HPLC- ELSD 芪红胶囊由黄芪、红景天、苦参三味中药组成，具有清热解毒、益气养阴、温阳散寒之功效。在组方中，黄芪为君药，具有补气固表、敛疮生肌之功效，其主要化学成分之一黄芪甲苷具有扩张血管及冠脉、 促进细胞及体液免疫、抗缺氧及抗疲劳等作用1-41。现采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法测定芪红胶囊中的黄芪甲苷，方法简便、灵敏、重复性好。 ( 基金项目：国家自然科学基金资助项目(批准号：30640080)；芪红胶囊专利号：2004100063223 ) ( 作者简介：宋晓东(1974-)，男，山西忻博，博助，助理研究员，从事心血管药理学和基因分子生物学的研究工作。 ) 网www. yuweichina.com邮箱watercom