兔血浆中阿霉素浓度检测方案(液相色谱柱)

北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2009，29(8)--1282 — 液相色谱-串联质谱法测定兔血浆阿霉素浓度* 刘奕明，林爱华**，邓时贵，欧润妹，巫志峰 (广州中医药大学第二附属医院，广州510120) 摘要 目的：建立测定兔血浆中阿霉素浓度的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法。方法：以柔红霉素为内标。血浆样品经液-液萃取法处理后，采用 RESTEK Pinnacle Ⅱ Cg柱(150 mm×2.1 mm，5 u.m)进行色谱分离，流动相为乙腈-10 mmol·L-醋酸铵-醋酸(70：30：1)，流速220uL·min电。用电喷雾离子化和正离子多离子反应监测方式检测阿霉素，检测离子为m/z544.2→397.2(阿霉素)和m/z 528.2321.3(内标)。结果：阿霉素在1.54~1025 ng·mL范围内线性关系良好，定量限为1.54 ng· mL-1；方法回收率为99.9%~101.3%，日内、日间 RSD 均小于 14.5%。结论：本法特异、灵敏、快速、准确，适用于兔血浆中阿霉素浓度的测定。 关键词：阿霉素；液相色谱-串联质谱法；血药浓度 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2009)08-1282-05 LC -MS/MS determination of adriamycin in rabbit plasma* LIU Yi- ming，LIN Ai-hua** ，DENG Shi -gui， OU Run- mei， WU Zhi -feng (Second Affiliated Hospital， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510120，China) AbstracttObjective：To develop a liquid chromatography - tandem mass spectrometry (LC -MS/MS) method forthe determination of adriamycin in rabbit plasma. Methods： Daunorubicin was used as the internal standard. Theplasma samples were pretreated by a simple liquid -liquid extraction. The analyte was separated on a RESTEK Pin-nacle ⅡCi8(150 mm×2.1 mm，5 p.m) column by isocratic elution with acetonitrile -10 mmol·L- ammoniumacetate - acetic aaid(70： 30：1) at a flow rate of 220 u.L· min'，and analyzed by mass spectrometry in the positiveion multiple reaction monitoring (MRM) mode. The precursor - to -product ion transitions of m/z 544.2→397.2and m/z 528.2一321.3 were used to measure and quantify adriamycin and daunorubicin， respectively. Results：Good linearity was achieved over the range of 1.54-1025 ngmL-，the limit of quantification was 1.54 ng ·mL-. The relative recovery was 99.9% -101.3%，and the intra - and inter - day precisions were less than14. 5%.Conclusion：The assay method is specific， sensitive， rapid ， accurate，and suitable for the determination ofadriamycin in rabbit plasma. Key words：adriamycin；LC-MS/MS；plasma - drug concentration 阿霉素(adriamycin，ADM)属蒽环类细胞毒性抗生素，抗癌谱广且治疗指数高，目前广泛用于白血病及乳腺癌、结肠癌、肝癌等实体肿瘤的治疗，但存在严重的心脏毒性和骨髓抑制作用。、甘草酸(gly-cyrrhizic，GL)表面修饰的 ADM壳聚糖纳米粒(GL-ADM-NPs)可提高 ADM 的肝细胞靶向性，降低其毒副作用。目前GL-ADM-NPs 的体内药代动力学研究尚未见报道。为考察GL -ADM -NPs与游离型 ADM 体内动力学行为的差异，建立合适 有效的 ADM 血浓测定方法十分必要。 关于生物样品中 ADM 浓度的测定国内报道有高效液相色谱法2~4]和液相色谱-质谱联用法[51，但这些方法均存在选择性差、灵敏度低、分析时间长等缺点，不利于药代动力学研究中大量样品的测定。本文采用正离子多离子反应监测(MRM)方式，建立了一种新的操作简便、快速、灵敏、特异的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定兔血浆中阿霉素的浓度，并用于 GL-ADM -NPs 的兔体内药代动力 ( **通讯作者 Tel：(020) 39318511；E-mail：linah76@163. com ) 1 材料 1.1 药品与试剂 阿霉素(ADM)对照品、柔红霉素(daunorubicin，DNR，内标)对照品，中国药品生物制品检定所提供；乙腈、醇，美醇 Fisher 公司产品，色谱纯；乙酸胺、乙酸，美国 Tedia 公司产品，色谱纯；氯仿，广州化学试剂厂产品，分析纯；水为去离子双蒸水。游离 ADM 溶液(F-ADM)：将ADM 原料药溶于生理盐水，新鲜配制；ADM壳聚糖纳米粒(ADM-NPs)和甘草酸表面修饰的 ADM壳聚糖纳米粒(GL-ADM -NPs)均为自制。 1.2 仪器 API 3000 型液相一谱-三级四极杆质谱联用仪(LC/MS/MS)，配有 Turbo Ionspray 离子源(ESI)及 Analyst 1.4数据处理系统，美国AB公司；1100液相色谱系统，Agilent 公司；BS224S 型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司； Allegra X-12R低温低速离心机，贝克曼-库尔特公司；AB-BOTT 台式高速离心机，德国雅培公司；IKA MS1 型旋涡混匀器；DB-30型样品浓缩仪，美国 TECHNE公司。 1.3 动物健康家兔，体重(2.78±0.24)kg，雌雄兼有，广州中医药大学实验动物中心提供。 2 方法 2.1 色谱条件 色谱柱：RESTEK Pinnacle ⅡC8柱(150 mm×2.1 mm，5 pm)；预柱：菲罗门公司Cg保护柱(4mm×2.0 mm)；流动相：乙腈-10mmol·L乙酸铵-乙酸(70：30：1)；流速：220uL·min；柱温：室温。 2.2 质谱条件 电喷雾 ESI 源；电喷雾电压(IS)为5500V；离子源温度(TEM)450℃；雾化气(NEB)为15；帘气(CUR)为12；碰撞气(CAD)为3；加热辅助气(GAS2)为6000 mL·min；碰撞能(CE)为19(ADM)和35(DNR)，碰撞室去除电势(CXP)为15(ADM)和10(DNR)；检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的离子分别为 m/z544.2→397.2(ADM)和m/z 528.1→321.3(DNR)。 2.3 对照品溶液配制 精密称取 ADM对照品4.1mg，置20 mL量瓶，加入50%甲醇溶解并定容，得到浓度为205 pg·mL的对照品储备液(ADM-1)，用50%甲醇依次稀释得到浓度为102.5，20.5，5.125，1.28，0.64，0.064 ugmL的系列对照品溶液，用于配制系列对照品血浆。同法得到浓度为210 pgmL的 ADM对照品储备液(ADM-2)，用 50%甲醇依次稀释得到浓度为 102.5，5.125，0.64pgmL"的系列对照品溶液，用于配制对照品血浆质控样品。精密称取 DNR(内标)12.8 mg，置25 mL量瓶，加入50%甲醇溶解并定容，得到浓度为512ug·mL-的对照品储备液，用50%甲醇稀释得到终浓度为800ng·mL-的对照品溶液。 2.4 血浆样品的预处理 取血浆0.2 mL，加入DNR 对照品溶液(800 ngmL-)40 uL，旋涡振荡10s，加入氯仿-甲醇(4：1)混合液2 mL，旋涡振荡3min，离心(3000 r·min-1，15 min)，吸取下层有机相，40℃水浴中N，流下吹干。残留物用流动相150pL充分溶解后，过膜(0.2um)，经自动进样器进样10 pL，进行 LC/MS/MS 分析。 3 结果 3.1 特异性 在选定的测试条件下，ADM和内标DNR 生成的基峰离子为其加H*离子[M+H]*，将其基峰离子作为母离子进行产物离子扫描分析，得到两者的全扫描及子离子扫描图，见图1。ADM 和DNR 保留时间分别为2.0 min 和2.38 min，血浆中内源性物质不干扰样品的测定，色谱行为见图2。 3.2 标准曲线和定量限 精密吸取 ADM对照品溶液，加入空白血浆，配成终浓度为1.54，4.48，12.8，41，123，303，410，1025 ng·mL 系列对照品血浆，按“2.4”项下方法提取后进样分析，以测得的 ADM峰面积与内标 DNR 峰面积的比值Y对药物浓度X进行加权线性回归(权重1/X²)，求得标准曲线方程为： Y=4.55×10-X-3.45×10-3 r=0.9994 表明该方法 ADM 在1.54~1025 ngmL-浓度范围内线性关系良好。定量限为1.54 ngmL。 3.3 精密度和准确度 配制浓度为4.48，123，922.5 ng·mL的对照品血浆(质控样羊)，按“2.4”项下方法提取后测定。每个浓度5份样品于同日内处理并测定，连续测定3d，采用方差分析法计算得到低、中、高3个浓度的日内 RSD 分别为6.1%，6.6%，4.0%；日间 RSD 分别为14.5%，10.8%，3.9%。相对回收率分别为(99.9±7.9)%，(101.0±7.5)%，(101.3±4.1)%。 3.4 提取回收率 测定浓度为4.48，123，922.5 ng·mL-的对照品血浆5份，以提取后的色谱峰面积与空白血浆提取后加入对照品溶液复溶后进样获得的峰面积之比(两者进样前浓度相同)，考察方法的提取回收率，结果低、中、高3个浓度的提取回收率分别为78.5%，82.9%，83.2%。 A B 图1 阿霉素(A)、柔红霉素(B)的全扫描质谱图(Ⅰ)和子离子扫描质谱图(Ⅱ) Fig1 Full scan mass spectra(Ⅰ) and product ion mass spectra(Ⅱ) of ADM (A) and DNR (B) 3.5 样品稳定性 将浓度为 4.48，123，922.5 ng· mL的对照品血浆，分别在室温放置6h(室温稳定性)和反复冻融3次(冻融稳定性)和样品处理后复溶的待测液在自动进样器放置6h测定，比较实测浓度与真实浓度，考察样品的稳定性。结果表明ADM 在上述条件下在血浆中均能保持稳定(表1)。 表1 阿霉素在不同处置条件下血样中的稳定性(n=5) Tab 1 Stability of ADM in plasma samples 加人量 回收率(recovery)/% (added) 室温稳定性 冻融稳定性 自动进样器稳定性 /ngmL- (bench stability) (freeze/thaw stability) (autoinjector stability) 4.48 100.3±4.1 92.3±5.5 97.6±3.4 123 99.6±5.3 101.0±3.6 96.9±1.8 922.5 98.2±9.4 95.4±1.8 103.2±6.8 3.6 稀释因子配制浓度为8.4 ug·mL-的对照品血浆5份，用空白血浆稀释10倍后按“2.4”项下方法提取后测定，将测定浓度乘稀释因子后与真实浓度比较，准确度为(104.6±4.3)%，表明对高于标准曲线上限的样品可用空白血浆稀释后测定。 3.7 方法应用 家兔15只，随机分为3组，分别自耳缘静脉注射给予游离 ADM溶液(F-ADM)、ADM壳聚糖纳米粒(ADM-NPs)和甘草酸表面修饰的ADM 壳聚糖纳米粒(GL-ADM -NPs)3 种药物，1min 内注射完毕，剂量以 ADM 计为 4 mg·kg。于给药前(0h)及给药后2，5，15，30 min 和1，1.5，2，3，4，6，8，10，24 h，在另侧耳缘静脉采血，置于肝素化抗凝管，离心(3000r· min") 15 min，分取血浆，于-20℃保存待测。用本文建立的方法对血浆ADM 浓度进行测定，血药浓度以当日标准曲线计算，平均血药浓度-时间曲线见图3。由图3可见血药浓度初期下降很快，表明药物在体内快速分布，其后衰减缓慢。血药浓度数据采用 DAS 2.1.1程序处理，结果F-ADR、ADR-NPs和 GL-ADR-NPs3种药物分别给兔静注注 ADM 的体内动力学行为均符合三房室模型(权重1/C)，求得的主要药动学参数见表2。 图2 血浆中 ADM和内标(DNR)的色谱图 Fig 2 Representative chromatograms for ADM (Ⅰ) and DNR (Ⅱ) in plasma samples A.空白血浆(blank plasma) B.空白血浆中加劣 ADM(1.54 ngmL-1)和内标( blank plasma spiked with 1. 54 ng mL- ADM and DNR) C.兔静脉注射 ADM后的血浆样品(a plasma sample of a rabbit after iv injection of ADM) --◆◆—F-ADM；一■—ADM-NPs；-▲-GL-ADM -NPs 图3 兔静脉注射游离 ADM 溶液(F-ADM)、ADM 壳聚糖纳米粒(ADM-NPs)和甘草酸表面修饰的 ADM 壳聚糖纳米粒(GL -ADM-NPs)4 mg·kg-后平均血药浓度-时间曲线图(n=5) Fig 3 Mean In (plasma concentration) -time curves of ADM in rabbitsafter iv F-ADM，ADM -NPs and GL-ADM-NPs 4 mgkg'，respec-tively 4 讨论 液相色谱-质谱联用技术因具有高选择性、高灵敏度和快速等优势而逐渐被广泛用于生物样品药物浓度的测定。最近有文献报道5)采用 LC - MS/MS 法测定 ADM 在犬血浆的浓度，但该方法灵敏度较低，定量限为37.5 ng·mL-，且 ADM 和内标的 保留时间分别为4.80 min和6.36 min，分析所用时间较长。本文建立的LC -MS/MS法灵敏度更高，ADM定量限仅为 1. 54 ng mL-，ADM 和内标的保留时间分别为2.0 min 和2.38 min，分析速度大大加快，提高了样品分析通量，更适合于药代动力学研究中大批量生物样品的测定。ADM 结构中含有氨基，呈弱碱性(pKa=8.3)，酸性条件下易发生离子化，因此在流动相中加入1%的醋酸有利于形成稳定的阿霉素加H*离子[M+H]*， 并且使离子响应和灵敏度也大大提高。比较了甲醇-醋酸铵、甲醇-醋酸、乙腈-醋酸铵等多种不同的系统，最终选择乙腈-10 mmol·L-醋酸铵-醋酸(70：30：1)作为流动相， ADM 和内标的色谱峰形良好，且不受内源性物质干扰。在内标的选择上，DNR与 ADM 的质谱行为相似，且保留时间较短，虽与 ADM 的保留时间接近，但由于高效液相色谱-质谱联用具有色谱分离与质谱分离的双重功能，可依靠质谱选择离子的检测能力区分不同物质的色谱峰，抗干扰能力强，因此不影响待待物ADM 的测定。 表2 兔静脉注主游离 ADM 溶液(F-ADM)、ADM 壳聚糖纳米粒(ADM-NPs)和甘草酸表面修饰的ADM壳 聚糖纳米粒(GL-ADM-NPs) 4 mg·kg后ADM 主要药代动力学参数(x±s，n=5) Tab 2Main pharmacokinetic parameters of ADM after iv F-ADM，ADM-NPs and GL-ADM-NPs 4 mg·kg"in rabbits 参数 F-ADM组 ADM-NPs 组 GL-ADM-NPs组 (parameter) (F-ADM group) (ADM-NPs group) (GL-ADM-NPs group) t1/20/h 0.059 ±0.013 0.041±0.023 0.039±0.016 t1/2p/h 1.14±0.17 0.509±0.232** 0.565±0.153** ty/2y/h 10.2±2.35 18.1±1.1** 19.0±2.6** V：/L·kg 0.721±0.221 0.302±0.085** 0.342±0.195* CL/L·h-1·kg- 2.55±0.26 1.88±0.48* 1.85±0.40* AUCo_/ng·ml.-1.h 1249±195 1525±325 1498±390 AUCo-c/ng·mL-i·h 1356±97 1844 ±547 1881±421 Cmax ngml. 6935 ±582 7359±353 7200±1636 *P<0.05，**P<0.01 us 游离 ADM溶液组(F-ADM group) 药代动力学的初步研究表明，家兔静注3种药物后，ADM-NPs 相比游离药物F-ADM，分布加快而消除半衰期延长；GL-ADM -NPs 的各主要药动学参数与 ADM -NPs 十分接近，经统计学分析无显著性差异(P>0.05)，表明甘草酸对纳米粒的修饰未改变纳米粒本身的动力学特征。 本文建立的LC -MS/MS 方法经考察，特异、灵敏、准确、快速，可用于血浆中阿霉素浓度的测定。用本法测定了15只家兔分别静脉注射3种ADM制剂后的血浆 ADM 浓度，证实本方法切实可行。 ( 参考文献 ) ( 1 LIN Ai-hua (林爱华)，LIU Yi- ming(刘奕明)，PING Qi -neng(平其能). 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