黄连上清丸中小檗碱检测方案(制备液相色谱)

In-cell cleanup净化过程29001woThermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.S CIENTIFI CPart of Thermo Fisher Scientific 车金水张艳海叶明立 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：快速溶剂萃取；在线净化；中药；黄连上清丸；小檗碱 Key words： Accelerated Solvent Extraction； In-Cell cleanup； TraditionalChinese Medicine； Huanglian Shangqing Wan； Berberine 引言 在分析基质复杂的样品时，萃取过程中干扰物质容易同目标化合物一起萃取出来，这些共萃取物干扰分析或影响仪器性能。通常需采用额外的净化步骤来对萃取液进行处理，以达到分析检测的目的，如柱层析法、固相萃取法(SPE)、凝胶色谱法(GPC)等。复方中药黄连上清丸基体组成复杂，主要组成药物17种，2010版药典对黄连上清丸中的小檗碱提取采用水浴，超声提取，浓缩提取液后过层析柱去除杂质，该方法操作复杂，耗时耗力。快速溶剂萃取技术(Accelerated Solvent Extraction， ASE) 是由美国戴安公司研发的一种新型的样品前处理方法，其原理是通过选择合适的溶剂在高高高压下快速提取固体、半固体样品。ASE具有萃取效率高，速度快、溶剂用量少等优点。同时ASE还具备选择性提取的功能—in-cell cleanup技术，即在萃取池底部填入合适吸附剂(见图1)，选择性吸附样品中的杂质，达到萃取净化同步完成的目的，极大的节省了操作时间和步骤。本方法采用in-cellcleanup ASE提取技术对复方中药黄连上清丸进行提取净化，取得了满意的效果。 图1. In-cell cleanup ASE条件 仪器：ASE350 前处理方法：取黄连上清丸水丸1g，精密称定，加入硅藻土(DE)适量，研磨，混合均匀。在萃取池(22mL)中垫入纤维素膜，加入5g碱性氧化铝，填平；将混合均与的样品加入萃取池中，快速溶剂萃取，萃取液定容，滤过，待HPLC分析。 表1.ASE萃取条件 ASE条件 参数 溶剂 甲醇 温度 140℃ 加热时间 7 min 静态萃取时间 5min 循环次数 2 吹扫体积 60% 吹扫时间 90s 总体积 40mL 总时间 20min 流动相：乙腈-33 mmol/L磷酸二氢钾溶液(35：65)柱温：30℃ 检测波长：270nm 进样量：10pL 图2.标准样品色谱图 参考2010版药典，以甲醇为萃取溶剂，其他ASE的萃取条件为：萃取温度140℃，静态萃取时间5 min， 循环两次。经实验证明(见表2)，该萃取条件能够完全萃取黄连上清丸中小檗碱。 参考2010版药典，采用碱性氧化铝作为在线净化吸附剂。取1g黄连上清丸样品，分别于萃取池底部添加不同量的碱性氧化铝，考察碱性氧化铝的量对净化效果的影响。实验结果表明：当不添加碱性氧化铝萃取时，HPLC分析小檗碱时，小檗碱色谱峰被杂质峰覆盖，干扰严重(见图5)。当碱性氧化铝添加量达到5g时，样品中小檗碱色谱峰未见干扰(见图6)，采用DAD检测器进行紫外光谱图扫描，±50%和100%处三张光谱图重叠良好，光谱匹配因子大于999.0，小檗碱色谱峰没有杂质干扰。比较未净化样品和净化样品色谱图，净化样品杂质峰明显减少(见图7，红线圈出部分)。 图3.萃取液颜色比较 (A：未添加碱性氧化铝；B：添加5g碱性氧化铝) 图4.碱性氧化铝颜色变化(A：萃取前；B：萃取后) 图5.未添加碱性氧化铝净化样品色谱图 图6.添加5g碱性氧化铝净化样品色谱图 图7.未净化样品和净化样品色谱图比较 ASE和药典方法比较 分别采用ASE在线净化技术和2010版药典方法对同一样品进行萃取，经HPLC分析得出结果(表2)。采用ASE在线净化萃取技术提取的样品中小檗碱含量为0.497mg/g，标准偏差为2.6%(n=3)；采用2010版药典方法提取的样品中小檗碱含量为0.474mg/g，标准偏差为3.5%(n=3)。采用在线净化-ASE萃取法和2010版药典方法对小檗碱的萃取率接近，但在线净化-ASE萃取法省去了药典方法中过层析柱，浓缩等步骤，大大简化了实验过程，实现了萃取净化一步到位的目的。 取方法：样品量溶剂量 耗时 样品含量(mg/g) RSD/% ASE 1g 40mL 20min 0.497 2.6 USE 1g 100mL 4h 0.474 3.5 采用in-cell cleanup ASE提取中药复方黄连上清丸中的小檗碱，和2010版药典推荐方法对小檗碱的萃取率接近，能够去除干扰小檗碱测定的杂质，能够达到萃取净化一步到位，同时具有操作简单、快速、高效等特点。 ( [1]国家药典委员会.中国人民共和国药典2010版 第一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010： 1066-1067. ) thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd i ts s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548