目前发光细菌毒性检测技术,即Microtox 技术已渐成为一种公认的微生物检测物质毒性的有效技术,与传统方法相比,它具有方法可靠,检测快速等特点,在环境检测方面得到广泛应用,本文在监测柠檬酸杆菌降解印染废水中蒽醌染料和偶氮染料的过程中,首次采用了Microtox 技术,研究了蒽醌染料和偶氮染料及其降解产物的生物毒性反应,为印染废水环境的生物修复提供了理论依据。
厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xiam en U niversity (Natural Science)第47卷 第6期2008年11月Vol.47 No.6Nov.2008 厦门大学学报(自然科学版)2008年°870· Microtox 技术在印染废水污染监测中的应用研究 王宾香,王 慧,郑天凌,2* (1.厦门大学生命科学学院,应用与环境微生物研究所, 2.近海海洋环境科学国家重点实验室(厦门大学),福建厦门361005) 摘要:利用发光细菌毒性检测技术(Microtox)研究了 Microtox 技术对印染废水毒性检测的条件,活性染料及降解中间产物对发光细菌的毒性反应,并对柠檬酸杆菌降解活性染料降解过程进行了监测.结果表明: Microtox 技术可以有效地监测活性染料及其微生物降解中间产物的相对毒性;活性染料的毒性远大于代谢途径中间产物的毒性;活性染料降解过程中培养液萃取物的毒性逐渐降低,但上清液的毒性出现先下降而后又增大的趋势,推测是上清液中存在的中间产物和其它组成成分及 pH变化综合作用的结果. 关键词:发光菌;M icrotox 技术;生物毒性;环境检测 当前活性染料以其色泽鲜艳、固色率高、染色牢度好等特点成为应用最广的一种染料,然而印染行业中所产生的大量未处理的或处理未达标废水通过地面径流、污水排放等方式进入江河湖海等环境中.这些印染废水潜在的毒性、致癌性和致畸致突变作用11-2,对江河湖海、生态环境具有重大的潜在危害,因此世界各国的环保部门对染料生产及使用厂家排放水的毒性提出了严格的限制要求.目前发光细菌毒性检测技术,即Microtox 技术已渐成为一种公认的微生物检测物质毒性的有效技术,与传统方法相比,它具有方法可靠、检测快速等特点,在环境检测方面得到广泛应用[3-7,18]本文在监测柠檬酸杆菌降解印染废水中蔥醌染料和偶氮染料的过程中,首次采用了 M icrotox 技术,研究了蒽醌染料和偶氮染料及其降解产物的生物毒性反应,为印染废水环境的生物修复提供了理论依据. 材料与方法 1.1 材 料 菌种:柠檬酸杆菌 CK3( Citrobacter ck3)由本实验室保存. 明亮发光杆菌( Photobacterium p hosphoreum)由中科院南京土壤研究所提供. 模拟印染废水:十二水硫酸氢二钠 31.7 g,磷酸二 ( 收稿日期:2007-12-12 ) ( 基金项目:福建省重大专项前期研究项目(2006YZ1023),厦门市 科技计划项目(3502Z20073009)资助 ) 氢钾3g,氯化铵0.5g,氯化钠0.5g,二水合氯化钙4mg,硫酸镁0.12 g, 维生素B1 0.15 mg,葡萄糖8g,蒸馏水1000 mL,染料 50 mg. 本研究所用的印染废水均为模拟印染废水. 1.2 发光菌菌液的制备 液体培养基:胰蛋白陈5 g,酵母浸出汁 5 g, NaCl30 g, Na HPO4 5 g, KH2PO41 g,甘油 3 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0. 固体培养基:培养液1000 mL,琼脂粉16g. 斜面菌种培养:将发光发冻干粉用0.5 mL 2. 5%NaCl 溶液悬浮,转入50 mL 培养液(250mL锥形瓶)中,20℃恒温摇床振荡培养24h 后转接于固体培养基(试管斜面),经20℃培养24h 为第一代斜面菌种;第一代斜面菌种再转接于固体培养基,经20℃培养12h后为第二代斜面菌种,备用.冰箱保存的菌种同样需经活化两代后备用. 摇瓶菌液培养:取第二代斜面菌种,接入50 mL培养液(250mL 锥形瓶)中,20℃摇床振荡培养12~14 h( 120 r/min). 菌液制备:取一定量上述培养液,用 3%NaCl溶液稀释,稀释液的初初发光度在600~1000mV之间,将稀释液放入摇床不断振荡充氧待用. 1.3 柠檬酸杆菌 CK3 降解模拟印染废水实验 将柠檬酸杆菌 CK3转接入LB培养基活化6h左右,然后将活化菌液(OD=0.2)转接入模拟印染废水中进行厌氧培养. 1.4 待测样品萃取物9-101 培养液在8000g下离心15 min, 去除上清液,用 二氯甲烷萃取,经无水硫酸钠脱水,高纯氮吹脱二氯甲烷后,于3%NaCl溶液中制成毒性测试液. 待测上清液:培养液在8000g下离心15 min,去除微生物细胞得到. 1.5 毒性检测 取2mL用3%NaCl稀释好的测液于具塞磨口比色管(直径1.2 cm,高5cm)中,每个浓度组做三个重复.迅速取 0. 05 mL 稀释菌液于各比色管中,加塞上下振摇10次,去塞,15 min 后将比色管插入生物毒性测试仪中,进行发光强度的检测(以仪器中光电倍增管受光量子感应后产生的微电流mV为信号,计量发光量),并以培养基或 3% NaCl 为对照,结果用相对发光度表示(样品管与对照管发光强度的比值(%),取3次重复测定的平均值). 1.6 数据处理 计算相对发光度或相对抑光率: 相对发光度(T%)=(样品管发光度/对照管发光度)×100% 用EC5o-15 m in值(15 min 时发光细菌半数发光抑制浓度)表达样品毒性:将己知毒物浓度与其相对发光度均值进行回归分析,建立相关方程,求出相对发光度为50%时所对应毒物的稀释浓度,即EC5o值. 2 结果与讨论 2.1 Microtox 技术对印染废水毒性检测的可行性研究 由图1可知,发光菌相对发光度在pH 为3时是27%,pH 为4时相对发光度急升到71%,pH 为5、6、7时,相对发光度增加变缓,但达到较高值,分别是80%、89%、92%,pH增大到8时,相对发光度开始下降,但也保持较高值,有84%,再增大 pH, 相对发光度急剧降低, pH 为9和10时,相对发光度值分别是66%和34%.本研究中所用的发光菌是从海水中筛选得到的一株明亮发光杆菌,由于海水具有较强的 pH缓冲能力,反应在图1上时,即当pH在5~8时,发光菌保持较强的发光强度,相对发光度都在80%以上,而当pH 呈强酸或强碱时(pH<3或pH>10),发光菌发光微弱(相对发光度 RL<35%).本研究中模拟印染废水的pH 在7.0左右,这时发光菌的发光强度较大,保证了实验的精度. 盐度对发光菌的相对发光度有较大的影响.从图2可见,当盐度<2.5%时,相对发光度随盐度的增高而变大,当盐度>4%时,相对发光度则随盐度的增大而降低,而当盐度处于2.5%~4%之间时,发光菌的 图1 pH对发光菌相对发光度的影响 Fig.1 Effect of pH on relative luminosity 图2 盐度对发光细菌相对发光度的影响 Fig.2 Effect of NaCl concentration on relative luminosity 相对发光度变化不大,均保持在90%以上. Microtox技术对盐度做出严格的要求12,操作时候必须维持3%的盐度,从图中可知,这是由于在3%左右的时候,发光菌的发光度比较稳定,并且具有较强的发光能力.本研究中印染废水初始盐度在0.5%,采用 Microtox技术来检测时,只要升高盐度到3%即可.M icrotox 技术的优势明显,该方法操作快速,结果准确,可以用来检测印染废水的生物毒性. 2.2 活性染料及降解中间产物对发光菌的毒性反应 本研究中活性蓝KN-R属蒽醌染料,活性黑 KNB和活性红KN-3B属双偶氮染料.3种活性染料对发光菌的抑制趋势均为随着浓度的增大而增大,即随着活性染料浓度的增大,发光菌活性减弱,相对发光度不断减小,其中图3-(a)(b)、(c)回归方程分别是 y= -1142.9x+ 102. 25(R’= 0. 965 2,p<0.01),y=-844. 05x+ 91.917(R’= 0.818, p< 0. 05)和y=-1304.8x+100.42(R’= 0.933 3,p<0.01),由回归方程知活性蓝KNR 的E Cso-15 min值和KN-3B相近,分别达到0.050和0.046 mg/mL,而活性黑KN-B的ECse-15 min 值是0.039 mg/mL.在 0~ 0.02 mg/mL之间,活性蓝KNR相对发光度减弱绝对值却有40%,比另外两种染料在这一区间减弱的绝对值要大 图3 活性红KN-3B(a)、活性蓝KN-R(b) 和活性黑 KN-B(c)对相对发光强度的影响 Fig.3 Effect of KN-3B(a), KN-R(b) and KN-B(c) onrelat ive lumino sity (活性红 KN-3B和活性黑KN-B分别减弱15%和17%);当CKNR> 0.02 mg/mL 后,相对发光度的减弱趋势变缓慢,在0.02~0.07 mg/mL 之间,减弱绝对值仅为20%,比另外两种偶氮染料在这一区间减弱的绝对值小很多(活性红 KN-3B 和活性黑KNB分别减弱65%和63%);染料浓度同为0.07 mg/mL时,活性红KN-3B的相对发光度为 15%, KNB也是15%,而KNR 还有 40%,即c> 0.02 mg/ mL 后活性蓝KN-R的相对发光度减弱趋势不如其他两种染料大.可见,蒽醌染料在低浓度区对发光菌的生物毒性较偶氮染料强,在高浓度时较偶氮染料弱,但仍然保持一个较高值. 活性染料KN-B、KN-R、KN-3B由于结构大不相同,水解出的中间代谢产物也有所区别,其中KN-3B先代谢出中间代谢产物间、邻氨基苯磺酸,随后再释放苯胺13-14,]而KN-B和KNR却先代谢出对氨基苯磺酸,再释放苯胺115-16]其中图4(a)(b)、(c)、(d)的回归方程分别为y=- 527.38x+101.18(R’= 0.940 4,p<0.01),y=-225.89x+ 102.96(R’= 0.938 9, p<0.01),y=-453. 57x+ 110.68(R’= 0.900 2, p< 图4 间氨基苯磺酸(a)、邻氨基苯磺酸(b)、对氨基苯磺酸(c)、苯胺(d)对相对发光强度的影响 Fig.4 Effect of met anilic( a), orthanilic(b), sulfanilic(c)and aniline(d) on relative lum ino sity 0.01),由回归方程知间氨基苯磺酸、邻氨基苯磺酸和对氨基苯磺酸 EC5o-15 min 值分别为0.097、0.230和0.130 mg/mL,相比于 KN-R、KN-3B和KN-B的EC5o-15 min 值0.050、0.046和0.039 mg/mL,KN-R、KN-3B和KN-B降解到间、邻和对氨基苯磺酸时,生物毒性明显降低,但降解水溶液中的间、邻和对氨基苯磺酸对发光菌还有一定的毒性,且随浓度的增大逐渐增大.苯胺 EC5o-15 min 值为 0. 41 mg/mL,活性染料降解到苯胺时生物毒性下降更加明显,较KN-B、KN-3B和KNR下降了10倍左右,但由于活性染料所带的基团比较多,其降解过程产生的中间产物比较复杂,特别是 pH 值对降解的途径影响很大,有文献报道KNB在酸性条件下降解产生乙基稀砜稀17,乙基稀砜生物毒性大,活性染料如果以这一降解途径降解,那生物毒性不是变小,而是升高. 2.3 柠檬酸杆菌降解活性染料过程中的pH及毒性变化 图5 pH在染料降解过程中的变化 Fig.5 Changes of pH in the degradat ion process 察其在降解过程中的毒性变化.配制一定量的印染废水,接种经两次斜面活化的柠檬酸杆菌,培养过程中培养基pH变化见图5.由图5可知,培养液初时 pH 变大,在12h时pH达到7.9,但随着培养时间的延长,在12~36h间, pH 由7.9降到5.0,由于代谢中间产物的产生和累积,酸性代谢中间产物改变了培养液的pH,酸性代谢产物越多, pH越低;当培养到72 h 后,pH 基本维持在4.0左右,变化不大. 培养过程中定时取样的培养液萃取物对发光细菌相对发光度的影响如图6所示.可见培养过程中相对发光度不断变大,说明活性发光细菌数量不断增加,萃取物的毒性不断变小.0~36h间,萃取物的相对发光度从32%升到63%,活性发光细菌数量增加, KNB消耗多,溶液中的生物毒性也降低;养到72h,相对发光度达到72%;72~ 108 h之间,相对发光度由72%升到78%,萃取物的相对发光度变化幅度趋于温和. 培养过程中培养基上清夜对发光细菌相对发光度的影响见图7.0~24h,上清液相对发光度持续增高,由32%升到53%,几乎成线性递增,36h 相对发光度弱增到56%,36h 后,上清液的相对发光度开始下降,36~ 60 h 之间,相对发光度由56%降低到35%.60h后相对发光度变化不大. KN-B 先代谢出对氨基苯磺酸,再释放苯胺15-16,相比较 KN B 的ECsc-15 min(0.039 mg/mL),对氨基苯磺酸和苯胺的 EC5o-15 min(分别是0.13和0.41 mg/mL)大为降低,从而溶液中的生物毒性也降低;由于染料的代谢途径较多,对氨基苯磺酸和苯胺并不是 KN-B 的唯一代谢中间产物和终产物,在酸性条件下,KNB也可降解成乙基稀砜117等有毒物质,再者 pH 值降低,生物毒性也会变大,如图7,在36~60h间,相对发光度变小.综合作用下上清液的毒性变化同萃取物的毒性变化不同,经过了变小到变大的两个过程,变化趋势比较复杂. 3:结 图6 培养液萃取物的相对发光度(以培养基为对照) Fig.6 Relative Luminosity of extractant ( constrastingw ith medium) 图7 培养液上清液的相对发光度(以培养基为对照) Fig.7 Relative Lum inosity of supernat ant fluid(constrasting wit h medium) 间产物的生物毒性,染料本身的毒性远大于中间产物邻、对、间氨基苯磺酸和苯胺的毒性; M icrotox技术检测到培养液萃取物的毒性在降解过程中不断减小,而上清液的毒性变化却比较复杂,经过了先下降后增高的过程,这是由于酸性中间产物的累积,导致 pH降低,而低pH对相对发光度的影响较大,再者一些其他途径的代谢中间产物,如乙基稀砜等,它本身也具有较强的生物毒性,这些因素综合作用后表现出一个复杂的过程. ( 参考文献: ) ( [1] C erniglia C E . B i odegradat ion of po l y cyclic aro matic hy - drocarbon: a r eview [ J ]. B iodeg radation, 1992, 3: 351 - 368. ) ( [21 Tian Y, Zheng T L, Wang X H. PAHs contamination andPAH-degrading bacteria in Xiamen We stern Sea [ J ]. 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Reactive dye was more toxic than its met abolit es, such as sulfanilic acid, ort hanilic acid, met anilic acid andaniline. M icrotox test demonstrated a decrease in the toxicity of culture ext racts from the culture containing react ive dye, and a de-crease followed w ith an increase in the toxicit y of culture supernatants over the incubat ion period. The metabolites and change of thecomponent of the medium and pH value must be responsible for the toxicity of the culture supernate together. Key words: photo bacterium; M icrotox test; biot ox icity; environmental monitoring c通讯作者meicozhatadreific Journal Electronic Publishing Ho ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
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Modern Water (英国现代水务)为您提供《印染废水中污染检测方案(水质毒性分析)》,该方案主要用于废水中综合检测,参考标准--,《印染废水中污染检测方案(水质毒性分析)》用到的仪器有Modern Water 毒性检测仪 Microtox M500