苦瓜籽中蛋白的提取和分离检测方案(紫外分光光度)

苦瓜籽蛋白的提取和分离 杨非徇 （四川得恩德药业有限公司 绵阳 621101） 摘要：用比较简便的方法提取苦瓜籽蛋白，并通过硫酸盐沉淀、透析、柱层析等步骤对蛋白进行纯化。 关键词：苦瓜籽 粉碎抽提 离心 盐析 透析 引言： 近年来国内外许多学者已经从苦瓜籽中提纯多种蛋白质，并对其生理活性进行研究，研究发现，主要有抑制真核细胞核糖体的蛋白质合成、抗艾滋病等活性，进一步研究表明，将苦瓜籽的核糖体失活蛋白与单克隆抗体偶联构成免疫毒素能特意性的杀伤靶细胞，因此，苦瓜籽核糖体失活蛋白在肿瘤、骨髓移植、自身免疫性疾病及艾滋病的治疗中有着潜在的广阔应用前景。 实验部分： 1． 材料与仪器 1.1材料：苦瓜籽250g，品种大白苦瓜籽，四川产，2003年8月采集。 1.2试剂：1mol/L Tris，50mmol/L乙酸 ，CM23 5mmol/L PBS（PH7.0）， QAE-sephadex-25，含250mmol/L NaCl的5mmol/L PBS ， （NH4）2SO4 1.3仪器：TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司） ，透析袋，层析柱，离心机（8000r/min），烘箱 2．实验方法： 2.1粗提液的制备：250g 苦瓜籽去壳，干燥后146g，粉碎后加入8倍体积的50mmol/L乙酸，在4℃下搅拌抽提2h，离心15min，用1mol/L Tris调节上清液pH至7.6，缓慢搅动24h，再离心15min，向上清液中加固体硫酸氨至90%饱和度，搅拌1h，静置2h，离心15min，收集沉淀，溶于尽量少的5mmol/L PBS（pH7.0），透析后浓缩至适当体积。 2.2柱层析： 将苦瓜籽粗蛋白粗提液上CM23柱层析完全后，用50mmol/L NaCl洗脱控制流速为1.5mL/min,洗脱至基线，每5mL测定一次275nm波长处的吸光度（见表1）： 表1 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 1 0.136 5 0.113 9 0.064 13 0.048 17 0.026 21 0.002 25 0.028 29 0.000 2 0.120 6 0.082 10 0.055 14 0.045 18 0.026 22 0.002 26 0.007 30 0.000 3 0.134 7 0.065 11 0.038 15 0.032 19 0.019 23 0.000 27 0.005 31 0.000 4 0.107 8 0.057 12 0.037 16 0.032 20 0.070 24 0.000 28 0.001 32 0.000 洗脱至基线后用250mmol/L的NaCl的5mmol/L PBS液洗脱，5mL测定一次吸光度（见表2）： 表2 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 1 0.003 5 0.008 9 0.710 13 0.178 17 0.095 21 0.014 2 0.000 6 0.010 10 0.321 14 0.168 18 0.069 22 0.013 3 0.000 7 0.018 11 0.193 15 0.133 19 0.055 23 0.005 4 0.007 8 0.230 12 0.170 16 0.114 20 0.031 24 0.000 收集吸光度从0.71开始的液体，并再次用250mmol/L的NaCl的5mmol/L PBS液洗脱，并收集吸光度高的液体，合并两次收集的液体放入预先处理好的透析袋内透析24小时。 将透析后的液体上QAE-sephadex-25柱，每流出10mL测定一次275nm波长处的吸光度，见表3（从10号管开始用PBS液洗脱） 表3 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 编号 吸光度 1 1.072 6 2.948 11 2.906 16 0.122 21 0.084 26 0.049 31 0.028 36 0.037 2 2.829 7 2.922 12 2.958 17 0.105 22 0.075 27 0.036 32 0.031 37 0.052 3 2.930 8 2.922 13 2.276 18 0.125 23 0.057 28 0.040 33 0.044 38 0.037 4 2.922 9 2.906 14 0.177 19 0.095 24 0.050 29 0.034 34 0.030 39 0.032 5 2.948 10 2.900 15 0.137 20 0.084 25 0.040 30 0.048 35 0.041 40 0.016 收集2—13号管的液体，冷冻，干燥，称重。 结果： 本方法采用时间较短，季氨乙基葡聚糖凝胶A—25的季氨乙基（—CH2CH2N+—（C2H5）CH2CHOHCH3，QAE型）使凝胶具有离子交换剂性质，有利于蛋白质、多肽等的分离。提取出的蛋白含量较高。 参考文献： 1.叶国杰、钱瑞卿、卢保元等，苦瓜籽蛋白的分离纯化极其性质研究，化学报。1998，56：1135。 2.孟延发、杜毅峰、张雪梅等，苦瓜籽核糖体失活蛋白的理化性质及生物活性，中国生物化学和分子生物学报，1999，15（6）：920。 3.郑永康，抗人体艾滋病毒的核糖体失活蛋白，大自然探索，1997，16（60）：62。