牛奶中褪黑色素检测方案(固相萃取仪)

全自动固相萃取-高效液相色谱-荧光法检测牛奶中的褪黑色素 编号： J-ANIET-3 摘要：本文建立了牛奶中褪黑色素的ASPE-HPLC (ASPE， Automatic Solid-Phase Extraction)法。牛奶中添加浓度为0.05 ug的褪黑色素标准物质，经蛋白沉淀后进行ASPE净化。 HPLC检测显示：褪黑色素在0.02-0.5 ug/mL范围内，线性关系良好，平均回收率为95.6%，平行测定三次添加回收的相对标准偏差(RSD) 为0.18%。该方法回收率、重复性和精密度好，适用范围广，满足褪黑色素检测的要求。 关键词：牛奶，褪黑色素， ASPE-HPLC 1果蔬样品处理 1.1样品提取 称取牛奶样品 10mL 加入1mL50%高氯酸溶液， 2mL30%(W/V) 硫酸锌溶液， 1ml 15%亚铁氰化钾溶液， 振荡1min， 离心5分钟(转速10000转/分钟) ↓ 过滤，取上清液3ml用氢氧化钠调节 PH值至2.6后待净化。 1.2样品 ASPE 净化 (1)待净化液采用 EXTRA-ASPE 进行净化 (2)在HLB (60mg，3mL)小柱上装上3mL柱密封塞 (3)将塞好密封塞的固相萃取小柱放入 EXTRA 全自动固相萃取仪的3mL SPE架上。 (4)将溶剂瓶 S1 中装入500 mL甲醇溶液；将溶剂瓶 S2 中装入500 mL2%甲醇溶液；溶剂瓶V1中装入800 mL水溶液； (5)在控制 EXTR-ASPE 系统的 PC软件方法设置界面上，设置牛奶中褪黑色素的固相萃取方法(详细步骤聚见表1)。 表 1 ASPE 净化详细方法列表 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 清洗 外针 水 6mL 120 mL/min 120 mL/min 活化 甲醇 3mL 15 mL/min 1.5 mL/min 水 3mL 15 mL/min 1.5 mL/min 上样 样品 3mL 15 mL/min 1.0 mL/min 空气 0.5mL 15 mL/min 2.0 mL/min 清洗 外针 水 6mL 120 mL/min 120mL/min 淋洗 2%甲醇 3mL 15 mL/min 1.5 mL/min 空气 6mL 60 mL/min 60 mL/min 洗脱 甲醇 3mL 15 mL/min 1.0 mL/min 空气 6mL 60 mL/min 60 mL/min (6)将待净化样品放入样品架内。 (7)设置运行界面，开始样品净化操作。 (8)固相萃取完成后，净化液于45℃下氮吹蒸发至干，用甲醇溶液定容至1mL，用于液相色谱分析。 2液相色谱检测条件 色谱柱： CNW Athena C18-WP 4.6mm*150mm，5um 柱温：30℃ 检测器：FLD 检测波长：激发波长：286nm，发射波长：352nm 流动相：甲醇：水=60：40 流速：1mL/min 进样量：10pL 3结果分析 3.1褪黑色素标准色谱图 图1褪黑色素标准HPLC色谱图 3.2牛奶中褪黑色素标准添加色谱图 图2牛奶中1褪黑色素标准添加 HPLC色谱图 平行测定3次添加实验，计算方法的平均回收率及相对标准偏差(RSD)如表2 表2样品加标回收实验 序号 化合物名称 标准加入量(ug) 回收一(%) 回收二(%) 回收三(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 褪黑色素 0.05 95.5 95.5 95.8 95.6 0.18 3. 结论 建立了 APSE-HPLC 法测定牛奶中褪黑色素的分析方法。实验显示：褪黑色素的平均回收率为95.6%、方法精密度为0.18%。 实验结果表明：该方法准确可靠，操作方便，重现性好。适合牛奶中褪黑色素的快速、准确检测。