豆瓣酱中罗丹明B检测方案(固相萃取仪)

Preekem 全自动凝胶净化色谱-高效液相色谱法检测豆瓣酱中罗丹明B 编号： SUFFE20151027 摘要：参考《SN/T 2430-2010进出口食品中罗丹明B的检测方法》标准，建立了利用全自动凝胶净化色谱结合高效液相色谱检测豆瓣酱中罗丹明B的方法。样品经环己烷-乙酸乙酯提取，经凝胶色谱净化系统净化，旋蒸定容过滤后，用荧光检测器检测。结果表明回收率良好，重现性高。 关键词：罗丹明B， FLEXI， HPLC-FLD 1引言 罗丹明 B(Rhodamine B)又称玫瑰红 B，或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种具有鲜红红色的人工合成的染料。经老鼠试验发现，罗丹明B会引致皮下组织生肉瘤，被怀疑是致癌物质。罗丹明B在溶液中有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。曾经用作食品添加剂，但后来实验证明罗丹明B会致癌，经历了2011年罗丹明B食品安全事件及2012年5月长沙罗丹明B染色辣椒案，已不允许用作食品染色。 本文参考《SN/T 2430-2010进出口食品中罗丹明B的检测方法》[，建立了利用全自动凝胶净化色谱(FLEXI) 结合高效液相色谱-荧光检测器联用 (High Performance Liquid Chromatography -FluorescenceDetector， HPLC-FLD)检测罗丹明B在豆瓣酱中残留量的方法。在环己烷-乙酸乙酯提取后，选用 FLEXI全自动凝胶净化色谱，自动完成大分子物质的分离和目标物收集等步骤，收集液再经旋转蒸发浓缩、定容后，用HPLC-FLD 检测。 罗丹明B分子结构式： 2 试剂、仪器及器材 2.1试剂 乙酸乙酯、环己烷、甲醇：色谱纯级； 1：1环己烷-乙酸乙酯溶液：取500mL环己烷，500mL乙酸乙酯等体积混合； 40%甲醇溶液：取甲醇40mL，加超纯水稀释至100mL； 1000 ug/mL 罗丹明B标准储备液：准确称取标准品 10 mg， 于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 1000 ug/mL 的罗丹明B标准储备液，，--18℃以下保存； 实验用水均为超纯水(电屯率=18MQcm)， 取自 Milli-Q制水机(Millipore， USA)。 2.2仪器及器材 全自动凝胶净化色谱： FLEXI，[，上海屹尧仪器科技发展有限公司； 高效液相色谱仪：戴安公司 UltiMate3000； 0.22 um 有机过滤膜：上海安谱实验科技股份有限公司； 分析天平；旋涡混合仪；离心机；旋转蒸发仪；移液枪； 250mL圆底烧瓶；玻璃滴管；样品管； 实验中所用玻璃器皿使用前均经450℃高温灼烧4h后冷却备用。 3实验方法 3.1前处理方法 3.1.1提取 称取2.0g样品(精确至 0.01g)于25mL容量瓶中，加入20mL等体积比的乙酸乙酯-环己烷，超声提取15min 后，用乙酸乙酯-环己烷定容。取15mL 溶液过 0.22um 微孔滤膜后作待净化液。 3.1.2净化 取 10mL待净化液于 FLEXI (GPC)样品管中，用于 GPC 进行净化，收集洗脱液，于40℃下旋转蒸发至近干c 3.1.3定容 残渣用1.0mL 甲醇溶解后，过 0.22um微孔滤膜，供 HPLC 荧光测定。 3.2检测方法 3.2.1FLEXI 净化程序 FLEXI净化程序如表所示。 3.2.2色谱条件 色谱柱为 CNWAthenaC18-WP，长度150 mm， 内径4.6mm， 涂层粒径5.0 um；柱温35℃，流速：0.8mL/min， 进样量：：：10.0uL；检测波长：Ex 550nm Em 580nm流动相为甲醇溶液(A)和水(B)，梯度洗脱程序如注：凝胶程：400*中25mm(ID)，填装 50g Bio-Beads SX-3，流速：5mL/min，定量环体积5mL， 流动相： 乙酸乙酯：环己烷=1：1 表，罗丹明B的标样色谱图如图1，豆瓣酱中罗丹明B的色谱图如图2 表1全自动凝胶净化色谱检测豆瓣酱中罗丹明B的净化程序 动作 立置 溶剂 体积 抽溶剂速度(mL/min) 打溶剂速度(mL/min) (mL) 满环上 16mL样品架-1 6 10 10 样 清洗注 注射阀 V1-乙酸乙酯：环己烷1：1 3 20 20 射阀 清洗探 针 外壁清洗 V1-乙酸乙酯：环己烷1：1 3 20 70 动作 起始时间 结束时间 收集体积 收集位置 馏分数量 单馏分体积 收集(样 250mL样品 注：凝胶疑：400*中25mm(ID)， 填装 50g Bio-Beads SX-3， 流速： 5mL/min，定量环体积5mL，流动相：乙酸乙酯：环己烷=1：1 表2流动相梯度洗脱程序 图1罗丹明B的标样LC 谱图 图2豆瓣酱中罗丹明B 的LC谱图 4结果与讨论 4.1样品基底加标回收率 在(2.00±0.01)g空白样品中添加一定量的罗丹明B标准混合溶液，使样品中目标物的量达到100 ng(50 ug/kg)，考察方法的回收率。进样量换算后基底的加标回收率为86.1%，回收率良好。 4.2样品检测结果 按照本文所述方法对33个豆瓣酱样品进行分析，根据检测结果发现基底较干净无干扰峰，基底加标回收率良好。以检出量大于等于 5ppb为有检出，33个实际样品中罗丹明B的检出率为 27.3%。 5 结论 本位采用样品经环己烷-乙酸乙酯提取，经凝胶色谱净化系统净化，有效地去除了样品中的干扰成分，旋蒸定容过滤后，然后利用高效液相色谱-荧光检测器联用进行检测。检测结果表明，该方法抗干扰性强，回收率符合要求。 ( 参考文献 ) 1. 《SN/T 2430-2010 进出口食品中罗丹明B的检测方法》