蜂王浆中磺胺类药物检测方案(固相萃取仪)

Preekem 全自动固相萃取-高效液相色谱法检测蜂王浆中的磺胺类药物 编号：SUFET151210 要：参考《GB/T 22947-2008蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》标准，建立了利用全自动固相萃取仪结合高效液相色谱串联质谱检测蜂王浆中磺胺类药物的方法。样品经超纯水提取，，三氯乙酸沉淀蛋白，混合型阳离子萃取柱(MCX柱)净化，用5%氨水的甲醇溶液洗脱并蒸干，转溶定容，0.22 um 滤膜过滤后，用质谱检测器检测。结果表明回收率良好，重现性高。 关键词：蜂王浆，磺胺类药物， EXTRA， HPLC-MS/MS 1引言 磺胺类药物(Sulfonamides， SAs) 是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。由于磺胺类药物抗菌谱广、性质稳定、使用方便、价格低廉等优点，其是禽畜抗感染治疗中重要的化学药物之一。由于磺胺类药物在动物体内的作用时间和代谢时间较长，口可能在其体内蓄积，而最终由食物链进入人体。其毒性作用主要体现在肾损伤、致肿瘤作用、过敏反应、造血机能破坏、消化系统障碍、免疫抑制、影响中枢神经系统等。 磺胺类药物是目前养蜂生产中治疗峰病的常用药物，也是蜂产品出口的必检项目。各国家、地区对蜂产品中的磺胺类药物残留做了一定限量规定：2007年日本规定蜂王浆中新诺明 (SMZ，主要成分为磺胺甲基异恶唑)的残留限量，将其残留列入了日本的监控计划中；国际食品法典委员会(CAC)和欧美等大多数国际规定食品(包括蜂产品)和饲料中的 Sas总量及磺胺二甲基嘧啶等单个种类的含量不得超过 0.1 mg/kg。 本文参考《GB/T 22947-2008 蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定高效液相色谱-串联质谱法》21，建立了利用全自动固相萃取仪 (EXTRA) 结合高效液相色谱-串联质谱联用 (High Performance LiquidChromatography- Triple Quad Mass Spectrometry， HPLC-MS/MS)检测磺胺类药物在蜂王浆中残留量的方法。9种磺胺类药物的 CAS 号及分子结构式见表1。在水提取、三氯乙酸除蛋白质后，选用 EXTRA 全自动固相萃取仪，自动完成SPE 柱活化、样品上样、淋洗、目标物洗脱和收集等步骤，收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换、定容后，用 HPLC-MS/MS 检测。 表19种磺胺类药物的分子结构式 Compound CAS Molecular Formula Compound CAS Molecular Formula 磺胺二甲基异 磺胺间甲氧 515-64-0 1220-83-3 嘧啶 嘧啶 H2N- HN- 磺胺嘧啶 68-35-9 磺胺氯哒嗪 80-32-0 ZHNN-=NHN- -IO NH2 NH2磺胺噻唑 72-14-0 磺胺甲恶唑 723-46-6 -NH 磺胺甲氧哒嗪 80-35-3 NH2 磺胺二甲氧 嘧啶 122-11-2 磺胺甲噻二唑 144-82-1 HN- HN 2试剂、仪器及器材 2.1试剂 乙腈、甲醇、甲酸、三氯乙酸：色谱纯级； 氨水：分析纯级； 50%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸5g， 用水溶解并稀释至5 mL； 洗脱液：吸取5mL 氨水与 95 mL 甲醇混合均匀； 定容试剂：取50mL甲醇、50 mL水混合均匀； 含0.1%甲酸的乙乙溶液(流动相B相)：取100 uL 甲酸、100 mL 乙腈混合均匀； 100 ug/mL 磺胺类药物标准储备液：分别准确称取标准品1 mg， 于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100 ug/mL 的磺胺类标准储备液，-20℃以下保存； 基质标准工作曲线溶液：吸取适量磺取类标准工作液，用空白样品提取液配成 5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 不同浓度的基质标准工作曲线溶液。 实验用水均为超纯水(电屯率=18MQcm)， 取自Milli-Q制水机(Millipore， USA)。 2.2仪器及器材 固相萃取柱： MCX， 60 mg/3 mL， 上海安谱公司； 全自动固相萃取仪：EXTRA，上海屹尧仪器科技发展有限公司； 高效液相色谱串联质谱联用仪： Agilent 1290 infinity - 6490 Triple Quad MS； 0.22 um 有机滤膜；分析天平；旋涡混合仪；超声波清洗仪；离心机；氮吹仪；移液枪； 50mL离心管；玻璃滴管；收集管；样品管； 实验中所用玻璃器皿使用前均经450℃高温灼烧4h后冷却备用。 3实验方法 3.1前处理方法 3.1.1提取 称取(2.00±0.01)g样品，置于50ml离心管中，加入20mL 水，于旋涡混合仪上混匀1 min， 再振荡提取 10 min， 加入0.5 mL 三氯乙酸溶液，快速摇动 30 s， 以3500 r/min 离心5 min， 将上层清液收集于烧杯中，样品残渣再加入20 mL水，重复萃取操作，合并提取溶溶，分取10mL于进样管，待净化。 3.1.2净化 MCX 固相萃取柱依次用2 mL甲醇、5mL水活化，取备用液过柱，流速1mL/min/，用3mL2%甲酸溶液及3 mL 甲醇淋洗固相萃取柱，用5mL洗脱液洗脱，收集洗脱液。具体程序见表2。 3.1.3定容 收集的洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，以定容试剂定容至1.0 ml， 经0.22 um 滤膜过滤后待进样。 3.2检测方法 3.2.1 EXTRA 净化程序 EXTRA 净化程序如表2所示。 3.2.2色谱条件 色谱柱为 Phenomenex Kinetex C18 柱， 长度100 mm， 内径3.0mm， 涂层粒径2.6 um； 柱温30℃，流速：0.25mL/min， 进样量：10.0uL。 流动相为超纯水(A)和含0.1%甲酸的乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序如下：0-2 min 10%B，2-6 min 10%-15%B， 6-8 min 15% B， 8.01-12 min 25%B， 12-16 min 25%-80%B， 16-18 min 80%B， 18.01-20 min 10% B. 3.2.3质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应选择监测(Multiple Reaction Monitoring， MRM)模式；鞘气温度(Sheath Gas Temperature) 350℃，鞘气流速(Sheath Gas Flow) 11 L/min， 氮气发生器提供；干燥气温度 (Dry Gas Temperature) 160 ℃，，干燥气流速 (Gas Flow) 16 L/min，氮气发生器提供；雾化气压力(Nebulizer Pressure) 30 psi； 喷嘴电压(Nozzle Voltage) 1500V；碰撞气 (Collision Gas) 为高纯氮气，气体纯度≥99.999%。质谱 MRM 采集参数见表3，，目标物标准品的 MRM 谱图见图1。 表2全自动固相萃取仪检测蜂王浆中的磺胺类药物的净化程序 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL) (mL/min) (mL/min) 清洗 外针 水 6 90 90 活化 甲醇 2 20 2 活化 水 5 20 2 空气 0.5 60 5 上样 样品溶液 10.5 20 1 空气 10 60 5 清洗 外针 水 6 90 90 淋洗 2%甲酸溶液 3 20 2 淋洗 甲醇 3 20 2 空气 10 60 20 洗脱 洗脱液 5 20 2 空气 20 60 20 表3目标物的LC-MS/MS MRM参数、工作曲线线性范围、相关系数 Compound MS Parameters Linear PI DI CE Range (m/z) (m/z) (eV) (ug/L) Sulfaisodimidine(磺胺二甲基异嘧啶) 279.0 124.1*，186.0 20，10 2-100 0.9985 Sulfadiazine(磺胺嘧啶) 251.0 156.0*，185.1 10，15 2-100 0.9986 Sulfathiazole(磺胺噻唑) 256.0 156.0*，108.0 10，20 2-100 0.9998 Sulfamethoxypyridazine(磺胺甲氧哒嗪) 281.0 156.0*，126.0，108.0 10，15，20 2-100 0.9984 Sulfamethizole(磺胺甲噻二唑) 271.0 156.0*，108.1 10，20 2-100 0.9993 Sulfamonomethoxine(磺胺间甲氧嘧啶) 281.0 156.0*.215.1 15，15 2-100 0.9977 Sulfamonomethoxine(磺胺氯哒嗪) 285.0 156.0*，108.0 10，20 2-100 0.9987 Sulfamethoxazole(磺胺甲恶唑) 254.1 156.1*，160.1 10，15 2-100 0.9956 Sulfadimethoxine(磺胺二甲氧嘧啶) 311.1 156.0*，245.1，218.0 18，15，15 2-100 0.9968 图1标准物质中目标物的 HPLC-MS/MS 谱图(浓度为50 ppb) 4结果与讨论 4.1基底加标回收率及精密度 在(2.00±0.01)g空白样品中添加一定量的标准混合溶液，使样品中目标物的量达到5 ug/g及 12.5 ug/g，考察方法的回收率和重现性。加标样品的 MRM 谱图见图2，基底加标回收率、相对标准偏差如表4所示： 图2加标样品的 MRM 谱图 表4蜂王浆中磺磺类药物加标回收率及相对标准偏差(n=4) Compound 5 pg/g 12.5 ug/g Rec% RSD% Rec% RSD% 磺胺二甲异嘧啶 116.4% 3.1% 88.7% 7.6% 磺胺嘧啶 82.9% 6.1% 102.5% 10.8% 磺胺噻唑 125.6% 2.7% 112.9% 8.4% 磺胺甲氧哒嗪 129.2% 4.2% 106.3% 9.1% 磺胺甲噻二唑 110.3% 2.9% 81.5% 9.4% 磺胺间甲氧嘧啶 109.6% 10.7% 112.2% 10.6% 磺胺氯哒嗪 94.0% 9.0% 76.9% 6.7% 磺胺甲恶唑 84.6% 4.3% 79.8% 8.4% 磺胺二甲氧嘧啶 104.3% 6.3% 103.6% 10.4% 4.2样品检测结果 按照本文所述方法对实际样品进行分析，基底干净，虽有两种物质的保留时间重叠，但由于其离子对不同，在质谱上可以良好分辨，不影响定性及定量判断。总体而言基底加标回收率良好，重现性符合要求。 5结论 本方法采用水对蜂王浆中的9种磺胺类药物进行提取，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，然后利用高效液相色谱-串联质谱联用进行检测。检测结果表明，该方法抗干扰性强，回收率符合要求，重现性高。 ( 参考文献 ) ( [1]王颖.高效液相色谱法检测动物性食品中磺胺药残留研究[D].扬州大学硕士学位论文，2009. ) ( [2] 1 《GB/T22947-2008 蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定高效液相色谱-串联质谱法》. )