大豆中蛋白分析检测方案(差示扫描量热)

粮食加工/2004年第2期 GRAIN PROCESSING/2004，No.258 黄友如，等：差示扫描量热技术及其在大豆蛋白分析中的应用/2004年第2期59 差示扫描量热技术及其在大豆蛋白分析中的应用 黄友如，华欲飞，裘爱泳 (江南大学食品学院，江苏无锡214036) 摘 要：主要介绍了热分析技术，重点分析了差示扫描量热仪的原理、结构、输出信息以及影响测量结果的主要因素。并举例说明了差示扫描量热技术在大豆蛋白分析中的应用。 关键词：热分析；差示扫描量热技术；大豆蛋白 中图分类号：207.3 文献标识码：A 文章编号：1007-6395(2004)02-0058-04 在升温或降温的过程中，物质的结构和化学性质会发生变化，其质量、尺寸及声、光、电、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化。热分析技术就是在温度程序控制条件下测量物质的物理性质与温度关系的一类技术。 大多数食品在收获、加工和制备的过程中都要经历某种程度的热处理。这些处理包括蒸煮、焙烤、蒸馏、巴氏消毒或灭菌、冷冻、冷藏以及烹煮。这些热处理均可使产品在形态、理化和功能性质以及流变学方面发生明显的变化，进而影响其质量和可被消费者接受的程度。因此对从事食品基础研究、产品开发和质量控制的食品科学家和科技工作者来说，热分析不失为一个有价值的工具。 热分析技术包括的范围很多，在程序控制温度下，若测量物质质量的变化，就产生了热重法等技术；若测量样品几何尺寸的变化，就有了热膨胀法；若测量样品的光学特性，则有热光学法；若测量样品的电学特性，则有热电学法；若测量样品的磁学特性，则有热磁学法；若测量样品的力学特性，有热机械分析和动态热机械法；若测量样品的热力学性质，则有差热分析和差示扫描量热法。 尽管热分析技术的范围很广，但在食品研究方面的应用却屈指可数。上述热分析技术中，差热分析和差示扫描量热技术应用得最为广泛。 差热分析(differential thermal analysis， DTA)是指在程序控温下测量样品和参比物的温度差与温度的关系的技术；差示扫描量热技术 (differential scanning calorimetry， DSC) 则是指在程序控温下测 ( 收稿日期：2003-09-22 ) ( 作者简介：黄友如(1966-)，男，讲师，博士研究生，主要从事植物蛋白制取、改性及应用研究。 ) 量输入到样品与参比物的功率差与温度的关系的技术。 由于 DTA 操作温度很宽，可达1600℃以上，而DSC 的操作温度仅在700℃以下，因而 DTA 可广泛应用于燃料和陶瓷工业。而大多数食品很少要加热到200℃以上，因此经典的 DTA 技术在食品的研究中受到限制，取而代之的是差示扫描量热技术。这里我们主要作以下介绍： 差示扫描量热技术的基本原理和分类[1，2] 热分析所测定的热力学参数主要是热焓的变化(△H)。由于在给定温度下每个体系总是趋向于达到自由能最小的状态，所以样品升温或降温的过程中，它可转变成具有不同自由能的另一种结构状态。分析伴随着结构变化所发生的热焓变化，就可以得到样品结构变化的某些信息。这就是用差示扫描量热法来分析生物大分子结构变化的基础。 不同的量热仪所依据的测量原理千差万别，量热仪的分类也有各种方法。例如，根据测量原理的不同，可以分为相变补偿型、热电效应补偿型、测量温差随时间变化型、测量温差随地点变化型等；也可以根据运行模式分为等温静态运行、恒温环境静态运行、绝热静态运行、绝热动态扫描运行、恒温环境扫描动态运行等；还可以根据构造原理分类，如双量热仪、单量热仪等。也有的量热仪是用人名命名，如 Bunsen 量热仪、Calvet量热仪等。 差示扫描量热法是60年代以后研制出的一种热分析方法。它是指在样品和参比物同时程序升温或降温且保持两者温度相等的条件下，测量流入或流出样品和参比物的热量差与温度关系的一种技 术。根据测量方法的不同，又分为两种类型：热流型DSC 和功率补偿型 DSC。 2 差示扫描量热仪的基本结构 差示扫描量热仪大致由下列几部分组成：(1温度程序控制系统；(2)测量系统；(3)数据记录、处理和显示系统；(4)样品室。 温度程序控制系统的功能是温度控制，其内容包括整个实验过程中温度变化的顺序、变温的起始温度和终止温度、变温速率、恒温温度及恒温时间等。测量系统将样品的某种物理量转换成电信号，进行放大，用来进一步处理和记录。数据记录、处理和显示系统把所测量的物理量随温度和时间的变化记录下来，并可以进行各种处理和计算，再显示和输出到输出和打印设备。样品室除了提供样品本身放置的容器(样品杯或样品管)、样品容器的支撑装置、进样装置等外，还包括提供样品室内各种实验环境的系统，如维持环境气氛所需气氛(氮气、氧气、氢气、氦气等)的输入测量系统、压力控制系统、环境温度控制系统等。现在的仪器一般由计算机执行仪器的温度控制、测量控制、进样控制和环境条件控制等控制功能并进行数据记录、处理和显示。 3 影响 DSC 测量结果的某些因素 差示扫描量热法的影响因素与具体的仪器类型有关，一般来说，影响 DSC 测量结果的主要因素大致有下列几方面： (1)实验条件的影响。实验条件包括起始和终止温度、升温速率、恒温时间等，其中影响实验结果的主要实验条件是升温速率。升温速率影响 DSC 测量的分辨率。实验中常常会遇到这种情况：对于某种蛋白质溶液样品，升温速率高于某个值时，某个热变性峰根本无法分辨，而当升温速率低于某个值后，就可以分辨出这个峰。升温速率还可能影响峰温和峰形。事实上，改变升温速率也是获得有关样品某些重要信息的重要手段。 (2)样品量。一般来说，样品量太少，仪器灵敏度不足以测出所要得到的峰。而样品量过多，又会使样品内部传热变慢，使峰形展宽，分辨率下降。实际应用中发现，样品用量对不同物质的影响也有差别。-一般要求在得到足够强的信号的前提下，样品量要尽量少一点，且用量要恒定，保证结果的重复 (3)固体样品的几何形状。样品的几何形状如厚度、与样品盘的接触面积等会影响热阻，对测量结果也有明显影响。为获得比较精确的结果，要增大样品盘的接触面积，减小样品的厚度，并采用较慢的升温速率。样品池和池座要接触良好，样品池或池座不干净，或样品池底不平整，会影响测量结果。 (4)固体样品的粒度。样品的粒度太大，热阻变大，样品熔融温度和熔融热焓偏低；但粒度太小，由于晶体结构的破坏和结晶度的下降，也会影响测量结果。带静电的粉状样品，由于静电引力使粉末聚集，也会影响熔融热焓。总的来看，粒度的影响比较复杂，有时难以得到合理的解释。 (5)样品的热历史。许多材料往往由于热历史的不同而产生不同的晶型和相态(包括某些亚稳态)，对 DSC 测量结果也会有较大的影响。 (6)溶液样品中溶剂或稀释剂的选择。溶剂或稀释剂对样品的相变温度和热焓也有影响，特别是蛋白质等样品在升温过程中有时会发生聚集沉淀的现象，而聚集沉淀产生的放热峰往往会与热变性吸热峰发生重叠，并使得一些热变性的可逆性无法观察到，影响测量结果。选择适当的缓冲液系统有可能避免聚集沉淀。 4 从 DSC 获得的信息与主要参量11，31 热分析既可以用于研究物理性质的变化，也可研究化学变化；不仅可测量热力学参数，也可提供一定的动力学信息。因此热分析在物质组分和结构研究及热力学和动力学研究上均是重要的分析手段。DSC 直接记录的是热流量随时间和温度变化的曲线，从曲线中可以得到以下一些重要的参数。 (1)转变温度。在食品研究领域，由 DSC 所观察到的转变主要是指诸如蛋白质变性、淀粉糊化和脂肪晶体熔化这样的过程。如果样品在升温或降温的过程中结构发生变化，样品就可能吸热或放热，如果样品分子发生结构变化的协同性比较高， DSC 曲线上就会出现一个吸热峰或放热峰，从 DSC 曲线上可以找到结构发生转变的温度即转变温度。 (2)热焓。热焓是一个重要的热力学参数，样品分子的物理变化(如相变)和化学变化(如物质的分解、键的断裂等)都与热焓有关，因此热焓的测定也就具有很重要的意义。我们所说的 DSC 测量的热 焓，确切地说应是焓变，即样品发生热转变前后的△H。对于压力不变的过程，△H 等于变化过程所吸收的热量Q.所以，有些文献中常常将焓变AH与热量Q等同起来。要比较不同物质的转变焓，还需要将△H归一化，即求出1摩尔样品分子发生转变时的焓变。实际测量时，只要将样品发生转变时吸收或放出的热量除以样品的摩尔数就可以了。现在DSC 的计算机中都有按照某种默认的原则计算峰面积的程序，从而使热焓的计算变得容易了。 (3)比热。 DSC 的灵敏度高，热响应速度快，操作简便；与常规的量热计热容测定法相比，样品用量少，测定速度快，操作简便。在 DSC 中，样品是处在线性的程序温度控制下，流入样品的热流速率是连续测定的，并且所测定的热流速率 dQ/ dt与样品的瞬间比热成正比，因此热流速率可用下列方程式表示： 式中：Q为热量，m为样品质量，C，为样品比热。样品的比热即可通过上式测定。 (4)样品纯度。根据样品和杂质的性质，纯度分析的方法可以是各种各样的。通常使用的传统化学分析方法比较复杂和费时，已逐步被仪器分析法所替代。用差示扫描量热法进行纯度分析，具有快速、精确、样品用量少等优点。用 DSC 测定物质纯度时，样品的纯度对 DSC 曲线的峰高和峰宽有明显的影响。因此，通过简单的峰形对比也可简便地估计样品的纯度。 (5)协同性。相变的急剧性表明了它是一种协同现象。相变的陡度依赖于相变过程中协同的分子数目，此分子数就称为相变的协同单位。 DSC 峰的宽窄(通常以半高峰宽来衡量)也可说明这种变性转变的协同性。如果转变发生在一个很窄的温度范围，说明它具有很高的协同性。 5 DSC 在大豆蛋白分析中的应用举例[4~10] 近年来，由于高灵敏度热分析仪器的出现，热分析在食品体系中的应用得到迅速发展，所研究的样品既有蛋白质、淀粉和脂类等生物大分子及其复合体系，也包括食品组织等混合系统。涵盖的范围既有食品的质量控制，也有食品方面的基础研究。由于样品的热性质和热力学数据与它们的结构的对应关系，人们常常可以通过样品的热力学特性来 了解其结构的变化。下面提供了 DSC 在大豆蛋白的热稳定性分析中的一些例子，以此来说明使用 DSC研究食物样品的一些思路。 在大豆蛋白改性方面， Petruccellil7l等人通过DSC 研究了大豆分离蛋白热稳定性中的 pH诱导的改性。与7S球蛋白的热稳定性相比，11S球蛋白的热稳定性较高且对 pH 变化很敏感。当pH值从6增加到11时， 11S大豆球蛋白变性温度降低10℃，而7S 球蛋白变性温度没有改变。在 pH11 时，大豆分离蛋白仅出现一个吸热峰，它代表两种球蛋白。随pH增加，11S球蛋白的构象发生了变化，这反映在变性过程中的协同性较低。与7S球蛋白相比，11S球蛋白的变性过程尚有一个较高的活化能。在 pH6~10范围内，11S球蛋白的活化能比7S球蛋白高，且在pH8时表现出最高动态稳定性。 在探讨金属离子对大豆蛋白功能性质的影响方面，Scilingo 等人I81通过 DSC 研究了钙和热处理对大豆分离蛋白热稳定性的影响。结果表明钙离子优先与11S成分相互作用。大豆球蛋白的活化能 Ea 值在钙含量为 6.51mg/g蛋白质时最小(51.12kcal/mol)。这个 Ea 值随着 Ca²+水平的增加或减少而增加。这些变化可能是因钙的存在引起蛋白质构象发生变化的结果。 在探讨有机溶剂对大豆蛋白热变性的影响方面， Grozav 等人I91通过 DSC 研究了乙醇对大豆球蛋白热变性的影响，在pH6.7，蛋白质和乙醇浓度分别为0.4%~4%以及0~3.2mol/L的范围内，结果发现大豆球蛋白成分的变性温度随乙醇浓度的增加而线性下降。大豆球蛋白成分的特异变性焓与蛋白质和乙醇浓度无关。 黄友如等人[10]分别是以样品 ASPI(以醇洗脱脂豆粕为原料制备的大豆分离蛋白)和样品 CSPI(以脱脂豆粕直接为原料制备的大豆分离蛋白)为材料作 DSC 分析比较。试验使用 Pyrix I型 DSC(美国Perkin -Elemer公司)，试验条件：扫描速率为10℃/min， 扫描区间为20℃~200℃，装样量为 5mg，试验结果见表1。 表1 两种大豆分离蛋白的 DSC 分析结果 样品 起始温度，℃ 峰值温度，℃终了温度，℃ 热焓，J/g ASPI 176.6 178.7 185.0 74.8 CSPI 128.7 144.8 166.2 34.0 从表1可以看出，豆粕经乙醇处理后制取的大豆分离蛋白，变性温度明显高于未经处理的样品，变性热焓明显增加。此外经乙醇处理的样品，峰型较尖锐，而其未经处理的样品，其变性峰的峰型极为平缓。这表明豆粕经乙醇处理后，大豆蛋白发生了一定程度的变性，在其后的分离蛋白制备过程中形成了较大的聚集体，从而使得变性转变的协同性增强；而未经乙醇处理的样品，蛋白质分子较为伸展，蛋白质内部疏水基团更多地暴露在外，疏水性增加，因而变性转变的协同性较低。 可见，与用一般谱学方法对蛋白质折叠/退折叠过程的监测不同，用微分扫描量热仪对折叠/退折叠过程的监测可以测定热力学量的变化，可获得更多的有关热过程的能量学信息，从而为蛋白质的分析研究提供了更广阔的视野。 ( [参考文献] ) ( [1 ] Wright， D. J . T hermoanalytical methods i n food research.In： Biophysical Methods i n F ood Research[M] . Ch a n， H. W. -S. (ed.). Bl a ckwell Sci e ntific Publications： London， 1984， 1 -36. ) ( [2]Ma， C -Y . ， H a rwalkar， V . R . and Maurice， T . J . I n-strumentation and techniques o f t h ermal a n alysis in food re - search. In： Thermal Analysis o f Foods [ M]. Harwalkar， V. R. and M a， C . - Y. (ed.). El s evier Scie n ce Publishers LTD， L ondon， 1990，1 - 1 5 . ) ( [3]Wr i ght， D. J . ， L each， J. B . and Wilding， P. Diff e rentialscanning c alorimetric studies of muscle and i ts constituentproteins[J]. J . Sci. Foo d Agric. 1977， 28：55 7 -564. ) ( [4] M yers， C. D . S tudy o f thermodynamics and k i netics o fprotein stabilit y b y thermal analysis . In： Thermal A nalysis o f Foods [M]. Harwalkar， V. R. and Ma， C . - Y. (ed.). Elsevier Scienc e Publishe r s LTD， London ， 1990 ， 16-5 0 . ) ( [5] A rntfiel d ， S. D.， Ismond ， M . A. H. a nd M urray， E. D . Thermal a n alysis of food proteins in re l ation to processingeffects . In： Thermal A nalysis of Foods[M]. Harwalkar，V.R. and M a， C. -Y. ( e d.). E l s e vier Science PublishersLTD， L ondon， 1990，51 - 91. ) ( [6]Ma， C . - Y. Th e rmal analysis of vegetable proteins and ve-getable protein -based food Products. In： Ther m al A n a - lysis of Foods [M ] . Harwalka r ， V . R . and Ma， C. -Y. (ed. ) . Elsevier Science Publishers LTD， London， 1990， 149-167. ) ( [71 P etruccelli， S. et al . PH - Induced Modifications in t h e Th- e r mal S tability of Soybean Protein Isolates . [J]. J. Agric.Food Chem. 1996，44：3005-3 0 09. ) ( [8] Scilingo， A. A. et a l. Calorimetric S t udy of Soybean Pro t ein Isolates ： Effec t of Calcium and Thermal t reatments. [J]. J. Agric . Food Chem. 1996 ， 44：3751 - 3 7 56. ) ( [9] Grozav ， E . K. et a l. S tudies on t he Effect of Ethanol on T h - ermal D enaturation of Soybean Globulins by Differential Sc-anning M icrocalorimetry. [ J].J. Food Sci. 1 985， 50： 1266- 1270. ) ( [10]黄友如.江南大学硕士论文[D].2002，12. ) DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY ANDTHE APPLICATIONS IN SOYBEAN PROTEINS HUANG You -ru， HUA Yu -fei， QIU Ai -yong (College of Food Science and Engineering Southern Yangtze University， Wuxi Jiangsu214036) Abstract： Thermoanalytical techniques with emphasis on differential scanning calorimetry are described in thisarticle. The principles， mechanism， characteristics measured by differential scanning calorimetry and the factorsthat affect measurements results are introduced. Moreover， the applications of differential scanning calorimetry insoybean proteins are also discussed. Key words： Thermal analysis； Differential scanning calorimetry； Soybean proteins (上接第57页)生。避免和减少泡沫溢出现象的办法：①可先加硝酸并放置浸泡至反应缓慢时再开始加热；若是油样，则先加硫酸小心混匀至变棕色，然后加硝酸、加热；②加热过程若产生泡沫，应立即停止加热，还可在消化瓶上口放置一只直形漏斗，或在不影响汞测定的情况下适当加些化学防泡剂。 3.4 使用五氧化二矾消化样品 用五氧化二矾消化样品时，可直接在50~100mL 锥形瓶中进行，不需要回流装置。该法适于消化大批样品，但注意加热时间不能太长，溶液更不能烧干。