海能仪器：烟草中含氮化合物检测方案(定氮仪)

Manon海能能仪 器民族仪器 品质典范 烟草含氮化合物测定 第一节烟叶中氮化合物的特性及其测定意义 1烟草中氮素形态： 蛋白质氨基酸酰胺 NH3硝酸盐植物碱未知氮化物 2烟草氮化合物分类： 1)水不溶性氮：：部分蛋白质(醇溶性和脂溶性蛋白质) 2)：水溶性氮：除去不溶性蛋白质，剩余氮化物都是水溶性的，其中也包括了水溶性蛋白质。蛋白质占整个含氮化合物的60%-90%，植物体中蛋白质的含氮量为15%-17.6%，平均为16%(蛋白质系数)烟草样品(干烟叶)中主要的含氮化合物是蛋白质(8%)和生物碱(1.5-3.5%)，其次是游离氨基酸(0.8%)等。 3含氮化合物测定意义 含氮量高的鲜烟叶，其多酚氧化酶活性也高，烘烤时易出现黑糟烟含氮化合物高的干烟叶，燃吸时，味苦，辛辣，刺激性强，杂气大。 第二节烟叶总氮测定 烟叶中总氮含量高，则其它氮化物含量往往也高，蛋白质和烟碱也高，因此测定总氮的含量对了解烟叶氮化物的特征具有代表性。 一、测定方法 测定主要有凯氏法和杜马法两种。 杜马法就是将烟叶燃烧，收集N2 和其它氮的氧化物，所用仪器十分精密。现在主要用的是凯氏法。 二、凯氏法定氮 原理：烟草中的含氮化合物用浓硫酸消煮分解，使其中各种形态的氮素全部转化为氨，并与硫酸结合形成硫酸铵，然后加碱(NaOH)蒸馏，使硫酸铵中的NH释放出来，用硼酸吸收，然后用标准酸(HSO4)滴定，计算出N含量。 1、烟样消化 在高温下浓硫酸是一种强氧化剂，能将有机物中的中全部分解氧化成 CO2，从而破坏了有机物的结构，样品中的含氮化合物，如蛋白质，在浓硫酸的作用下，水解为氨基酸，氨基酸脱氨产生 NH3，NH3 与硫酸结合成为硫酸铵留在溶液中。 2、蒸馏 向消化液中加入过量的强碱 NaOH， 使(NH4) 2SO4 的 NH3逸出，并用硼酸溶液吸收之。 3、滴定 用标准酸滴定硼酸吸收的氨，根据标准酸的用量计算出消化液中的N量。 这种测定总氮的方法最初是由凯德尔(Kjeldahl) 1884年在研究蛋白质中的N时发明的，所以叫凯氏定氮法。该种方法测定结果准确可靠，但是 (1)消化时间过长，浓硫酸(沸点360℃)在360℃下加热分解烟样需 5h以上。 (2)标准液配制麻烦。原始的凯氏定氮法中，需要配制两种标准溶液(H，SO4和NaOH)。因为最初是用 H，SOA吸收蒸馏出来的 NH3，然后用 NaOH 滴定多余的H，SO4. 2凯氏法的改进 缩短消化时间 A加入增温剂K，SO4或 Na，SO4 K，SO4可以提高消化液的沸点，加速有机物质分解。K，SO4可以将消化液的沸点升高到400℃以上，但是一般应控制在360-400℃之间，如果加入K，SO4量过多，则会使沸点温度超过400℃，使生成 的硫酸铵也会被分解释放出氨。。一般每毫升硫酸加入0.5K，SO4即可。Na，SO4的作用与K，SO4相同，但效果稍差。 B加入催化剂 CuSO4 起催化作用的试剂还有有 Hg HgOSe FeSO4NiSO4 从催化效率看硒>汞>铜，但是汞和硒都有毒，不常使用。CuSOA是目前广泛使用的催化剂。 催化剂和增温剂混合同时使用效果更好， CuSO4： K，SO4=1：l：110 C加入氧化剂 H2O2HCIOK，CrO，氧化剂主要是提高消化液中的氧气，使供氧充足，大大缩短了消化时间。HClO4和K，CrO，作氧化剂，可以将消化时间缩短到30-60min， 但是K，CrO，会引入K离子，不能一液多用测定烟样中的K含量。HClO4不稳定。 1) 蒸馏方法改进 a改全部蒸馏为部分蒸馏 b承接流出液由硫酸改为硼酸 NH和硼酸没有起化学反应，而是吸附在硼酸分子上。 2) 滴定方法改进 由用标准 NaOH 滴定 H，SO4，改为用 H，SO4滴定硼酸吸附的 NH3。 3) 消化工具改进 改进前：凯氏瓶电炉 改进后：消化管 红外线消煮炉 每批可以作40个样品。 改进后形成了许多不同的方法，主要以消化时所加的试剂不同命名： 1.H，SO4-HO法稳定，N不损失，2-3h 2.H，SO4-K，SO4法 稳定，时间长，不可测K 3. H，SO4-K，SO4-CuSO4法稳定，时间长，不可测K 4. H，SO4-HClO4法时间短，不稳定，N易损失 5. H，SO4-K，CrO4法时间短不稳定N易损失不测K 三、H，SO4-HO，消化法测烟草总氮 1原理用强氧化剂高温消煮烟草样品，将其中的有机物质氧化成 CO2，各种形态的氮素全部转化为氨，并与硫酸结合形成硫酸铵，然后用碱(NaOH)蒸馏，使硫酸铵中的NH，释放出来，并用硼酸吸收，最后用标准酸(HSO4)滴定硼酸吸附的 NH3， 并计算出样品N含量。 2步骤 1) 消化 0.2g样品于消化管中，加6mL 浓硫酸，放置过夜(也可直接消化)――于消煮炉上先低温慢加热至开始冒出大量白烟，待白烟减少时，取出稍冷却，逐滴加入30%H，O，10D， 充分振荡-――继续放于消煮炉上加热，再冒白烟，再沸腾，待白烟再减少时，取出稍冷却，逐滴加入30%H，O，8D 充分振荡-再继续消煮，每次待白烟减少时滴加的HO量都比前次减少2D， 直至最后溶 液澄清无色。最后一次滴加HO后应继续加热沸腾 5-10min，e以除尽 H02. 在消煮的同时作2份空白试验：可以用葡萄糖代替烟样，也可以不用葡萄糖，直接将 6mL浓硫酸进行消化。 消化液冷令，加水稀释后定容 100mL消化液颜色变化：黑色一―酱油色――红宗色―-黄色―无色 2) 蒸馏 从 100mL 待测液中取 10mL 于半微量凯氏定氮整流器中，加5mL40%NaOH溶液蒸馏。流出液用加有 2D 溴钾酚绿一甲基红指示剂的2%硼酸 5mL 吸收。指示剂颜色变化：红紫色--兰紫色 3) 滴定 用已知浓度的标准酸0.01mol/LH，SO4滴定流出液中被硼酸吸附的 NH， 溶液颜色变化：兰紫色――微红色，根据标准酸的用量计算出烟叶总氮含量。 四、扩散皿法测烟叶总氮 1原理同消煮法 2待测液制备同消煮法 3用扩散法代替蒸馏法将待测液中硫酸铵中的 NH，扩散进入硼酸溶液中，然后用标准酸滴定硼酸溶液中吸附的 NHz。 扩散皿的内室(低)装入2mL硼酸溶液，外室(高)加入1mL待测液盖上毛玻璃，边缘涂上碱性甘油密封后，从小空向外室注入1mL40%NaOH溶液，立即密封。在25-30℃扩散 24h。扩散温度不易超过30℃，否则扩散皿会破裂。 第三节、烟草中蛋白质测定 一、间接法：通过测定样品中蛋白质的含氮量来推算蛋白质的含量的方法。 1间接计算法 粗蛋白质%=(总N%-烟碱%*0.1728)*6.25 2间接测定法 1)原理：先把蛋白质从烟样中分离出来，然后对含蛋白质的沉淀进行消化，蒸馏和滴定，测出蛋白质中总氮含量，然后根据蛋白质系数6.25换算出蛋白质含量。 2)步骤 2g样品于烧杯中，加入50mL沸水，6%CuSO4 和NaOH各25mL--加热搅拌15min， 放置1h滤―过滤，蛋白质形成的沉淀留在残渣中，虑液中是水溶性氮化物。这就将蛋白质和水溶性氮化物分开了――取下带虑渣的漏斗60℃稍烘干―――滤纸带残渣一并放入消煮管内消化，蒸馏，滴定，测定出蛋白质含氮量，并计算出蛋白质的量。 蛋白质%=蛋白质 N%*6.25 二、直接法：根据蛋白质的理化性质如，对紫外光的吸收，双缩尿反应等测定蛋白质的含量。 鲜组织中蛋白质的测定最常用的是考马斯亮蓝法，该法用牛血清蛋白作工作曲线牛血清蛋白需在低温冰箱中保存。 第四节水溶性总氮的测定 烟叶总的氮化物包括：：1可溶性氮2不可溶性氮 间接测定法测定蛋白质时，将烟叶总的氮化物分为两部分： 1 蛋白质 2除去蛋白质外的水溶性氮化物 水溶性总氮包括：：氨态氮，酰胺态氮，氨基态氮 因此将除去蛋白质的水溶液消化后，按照凯氏法测定其中的氮含量，就是水溶性总氮. (一)酰胺态氮的测定 1、原理：酰胺化合物在酸性或碱性条件下都易于分解产生 NH3 H+ 十R-C-NH2_→ R-C-0H + NH40OH- 0R-C-NH2R-C-0- + NH3 用3M硫酸加热水解水溶性氮液，使酰胺全部水解产生硫酸铵，用NaOH中和硫酸，再以缓冲溶液(硼砂+NaOH)在低温低压条件下蒸馏，使酰胺分解产生的 NH3 逸出，，自由态 NH3 也逸出，其他形式的N化合物不被分解，这样蒸馏出来的 NH3 包括了酰胺氮和自由氨所含的氮。从中减去自由氨中的氮，即为酰胺氮 (二)自由态氮的测定 原理：自由态氮易挥发，如果在强碱介质中蒸馏，其他形式的氮也被蒸馏出来，因此在缓冲溶液中并且低温低压条件下，直接蒸馏水溶性氮待测液，测出的就是自由氨中的氮。 与酰胺氮测定的区别：免去3M硫酸水解，及加NaOH中和 (三)总植物碱氮的测定 烟草中主要的植物碱：烟碱，，降烟碱，新烟草碱，假木贼碱总植物碱氮近似=烟碱x0.1728 (四)未知来源的氮测定 烟草可溶性氮化合物包括：自由氨，酰胺，烟碱，胺和其他形式未知态氮化合物。用强碱蒸馏可溶性氮液，己可以将各种形式泊氮化合物都蒸馏出来，除植物碱外，都是以 NH3-N 的形式被承接(盐酸)吸收的。以铵盐存在。铵盐可以和纳氏试剂显色，在一定范围内颜色深浅和铵盐量成正比。 未知N%=比色测得 N%-自由态氨 N%-酰胺态 N% --