饲料中含氮量检测方案(定氮仪)

Manon海：角能能仪 器民族仪器 品质典范 杜马斯燃烧法与凯氏法测定饲料含氮量的比较 摘要：文章以20种常见的饲料原料和2种化学标准物为试验材料，分别采用凯氏法和杜马斯燃烧法测定各饲料样本中的含氮量，并将其中11种样本分别送往3个实验室进行凯氏法和杜马斯燃烧法的测定，分析误差来源，以确立一种快速无污染的饲料含氮量测定方法。结果表明，，两种测定方法呈显著线性相关(r=0.9998， P<0.001)，而且大部分蛋白质饲料和能量饲料的含氮量测定值间没有差异(P>0.05)，变异系数(CV)<5%，但在测定羊草、小麦秸、玉米秸和稻草时，两种方法的测定值间存在显著差异 (P<0.05， CV<5%)。在3个不同的实验室使用凯氏法测定时，7种样本间存在显著差异(P<0.05)，其中2种样本的CV 大于5%；而使用燃烧法时，只有2种样本存在显著差异(P<0.05)，并且所有样本的实验室间 CV均小于5%。11种饲料样本在3个不同实验室间测定值的平均 CV 值表现为燃烧法明显小于(P<0.01)凯氏法。 关键词：饲料、含氮量、杜马斯燃烧法、凯氏定氮法 粗蛋白含量是衡量饲料原料和动物产品营养价值的一个重要指标，因此，准确测定动物饲料及其产品中的粗蛋白含量是动物饲养和营养的核心内容之一。100多年前，凯氏定氮法就被应用于测定各种物质中的含氮量[1]。但由于凯氏法的测定耗时长，并且需要使用危险化学试剂，易造成环境污染，危害人类健康， 因而随着氮元素分析设备的不断改进，杜马斯燃烧法逐渐替代传统的凯氏定氮法，用于测定动物饲料[2~4]、肉类制品[5]、谷物籽实和含油种子[6]，液态奶[7]中的含氮量。其测定原理是待测样本在纯氧(≥99.99%)环境中高温燃烧，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成氮的氧化物后被还原剂还原成氮气。最后，用TC检测器检测氮气产量。基于此原理，杜马斯燃烧法不仅能够在4~6分钟内准确地测定出样品的总氮含量，而且还能测定出凯氏法所不能测定的饲料硝态氮。 杜马斯燃烧法已经被美国、德国、英国、日本等发达国家采用，作为饲料粗蛋白含量的官方测定方法。但是，在众多的发展中国家，利用杜马斯燃烧法测定各种饲料和饲粮中含氮量还很少。随着人们对环境和健康问题的日益关注，常规凯氏法测定饲料含氮量所带来的酸碱废物污染问题促使人们寻找新的方法代替凯氏法。本研究设计2个试验，分别采用杜马斯燃烧法和凯氏法测定多种饲料原料中的含氮量，并分析误差来源，为杜马斯燃烧法的利用提供科学依据。 材料与方法 1.1样本来源和处理方法 选取20种饲料原料和2种标准化学试剂为样本，其中包括5种粗饲料(玉米秸、玉米青贮、羊草、小麦秸、稻草)，6种能量精料(玉米、小麦麸、小麦、大麦、高粱、大豆皮)，9种蛋白质饲料(大豆粕、菜粕、棉粕、血粉、羽毛粉、鱼粉、DDGS、酵母、尿素)以及硝酸铵和 EDTA。所有样本均在70℃烘箱内干燥72h。用锤片式粉碎机粗粉碎(孔径约2mm)后再用旋风磨(0.5mm筛)进一步粉碎，并置于封口塑料袋中，分别用杜马斯燃烧法和凯氏法测定其含氮量。 1.2测定方法 1.2.1凯氏法：称取一定量的饲料样品(粗饲料0.8g，蛋白质饲料和能量饲料0.6g)于消化管中，加入催化剂(3.5gK2SO4，0.4gCuSO4)，并注入10ml浓硫酸，在200℃ 下消化 1h 后升温到400℃持续3小时，至消化液变澄清为止。利用自动蒸馏器在添加40%氢氧化钠溶液(40ml)后蒸馏5min，用标准盐酸溶液滴定硼酸吸收液。 1.2.2杜马斯燃烧法：采用氮素自动分析仪完成。称取 0.2g饲料样品包于特制锡箔中，并置于自动落样器上。样品落入入烧反应炉(960℃)后，在通氧量为170ml/min 的高纯氧(≥99.99%)中充分燃烧300秒，直至氧剩余量达到12%时停止燃烧。燃烧反应炉中的试剂依次为280g 氧化铜，13g银丝，15g铂。燃烧炉中的产物(NOx)被载气 CO2运送至还原炉(800℃)中，经铜针和钨还原生成的氮气除去水后，进入 TCD 检测器检测。测定结果由计算机自动输出和打印。 1.3不同实验室测定 将11种饲料样本分别按1、2.....11编号，分别送某大学和某研究所进行凯氏法含氮量盲测，各实验室所用的仪器均为凯氏自动定氮仪。同时，将按上述编号的11份样本分别送杜马斯仪器厂家2个实验室和本实验室进行杜马斯燃烧法氮素含量测定，所用仪器为德国生产的自动动素分析仪。 1.4统计分析 利用 SAS[8]统计软件(SAS， 1996)中的广义线性模型(GLM)进行方差分析和多重比较(SNK)。回归分析采用REG模型，并对相关系数和截距进行t检验。 2 结果与讨论 2.1杜马斯燃烧法与凯氏法测定饲料含氮量结果的比较 表1列出了分别用凯氏法和杜马斯燃烧法测定20种饲料原料和2种化学标准物中含氮量的结果。由表可见，随饲料种类的不同，两种方法测定值间的差异有所变化。虽然在测定能量饲料时两种方法变异性不大(P>0.05， C/K=0.99~1.04)，但在5种粗饲料中，玉米秸、羊草、小麦秸和稻草的测定结果之间都存在显著差异 (P<0.05)，燃烧法的测定值高于凯氏法(D/K=1.06~1.21)。根据Watson[9]报道，这可能与粗饲料和秸秆中的硝态氮含量有关，而且本试验硝酸铵测定值之间的显著性差异 (P-0.001)也进一步说明了这个问题。青贮玉米秸的测定值间不存在显著差异(P-0.1559)，这也证实了 Ataku[10]和 Spoelstra[11]关于饲料原料在青贮过程中硝酸盐含量会降低的观点。大部分蛋白质饲料差异不显著(P>0.05)，菜则测定值之间的差异可能来源于其 SEM 较小，鱼粉和 DDGS测定值的变化可能与微生物作用产生腐胺和尸胺有关。从总体上看，两种方法的变异系数均小于5%，如图1所示测定值间呈显著线性相关(r=0.9998，P<0.001)，拟合直线与Y=X重合性好，截距呈显著相关(P<0.05)。大部分饲料的燃烧法测定值略高于凯氏法(图2)，其中在测定能量饲料时，两种方法的差值最小，这可能与饲料中硝态氮含量低有关。在蛋白质饲料中，尿素的凯氏法测定值略高于燃烧法(P>0.5)，这可能与尿素在燃烧法测定时的不完全燃烧有关。全部22种含氮物质的平均变异系数凯氏法显著高于 (P<0.05)杜马斯燃烧法。因此，杜马斯燃烧法完全能够替代凯氏法用于测定饲料的含氮量。 表1常用饲料原料含氮量(%DM)的凯氏法与燃烧法测定值 Table 1 Nitrogen contents (%DM) of various feedstuffs as determined by Kjeldahl method and Dumas combustion method 测定方法(Determine method) 饲料原料 C/K 燃烧法 凯氏法(Kjeldahl) SEM P= Feedstuffs) CV2 CV 3 Combustion) 玉米秸(corn stalks) 1.05a 0.34 0.93b 2.06 1.13 0.010 0.012 玉米青贮(Corn silage) 1.36a 0.28 1.28a 3.83 1.06 0.025 0.156 羊草 Chinese wild-rye grass) 1.04a 0.23 0.94b 1.53 1.10 0.007 0.012 小麦秸(Wheat straw) 0.72a 1.65 0.59b 1.19 1.21 0.007 0.006 稻草Rice strawy 0.90a 0.41 0.74b 0.69 1.21 0.003 0.001 大豆粕(Soybean meal) 8.02 0.25 7.96 0.12 1.01 0.016 0.051 菜粕(Rape seed meal) 6.52a 0.11 6.18b 2.53 1.05 0.009 0.001 棉粕(Cotton seed mealy 7.05 1.40 6.77 1.14 1.04 0.086 0.153 血粉 Blood mealy 14.87 0.45 14.85 0.08 1.00 0.034 0.744 羽毛粉(Feather meal) 12.13 2.39 12.05 2.25 1.01 0.199 0.810 DDGS 4.54a 0.25 4.29b 1.17 1.06 0.026 0.021 鱼粉(Fish meal) 11.62a 0.19 10.93b 0.63 1.06 0.036 0.006 酵母(Yeast) 7.18 0.05 7.18 0.97 1.00 0.035 0.922 尿素(Urea) 46.52 0.53 46.75 1.09 1.00 0.283 0.619 玉米(Corn) 1.53 0.17 1.51 3.33 1.00 0.026 0.950 小麦麸(Wheat bran) 2.44 0.53 2.46 0.17 0.99 0.007 0.176 小麦(Wheat) 2.76 0.47 2.75 0.82 1.00 0.006 0.893 大麦(Barely) 1.73 0.30 1.71 0.49 1.00 0.010 0.464 高粱(Sorghum) 1.74 0.52 1.75 0.68 1.01 0.025 0.260 大豆皮(Soybean hully 1.80 0.31 1.72 0.26 1.04 0.016 0.082 EDTA 9.58 0.76 9.40 0.50 1.02 0.044 0.098 硝酸铵(Ammonium nitrate) 29.29a 1.17 19.55b 1.76 1.50 0.244 0.001 平均 0.58 1.24 0.177 0.011 同行平均数具有不同肩标字母者差异显著(P<0.05)。下同 CV2表示变异系数。C/K3 表示燃烧法与凯氏法的比值。 图1饲料含氮量的凯氏法测定值与燃烧法测定值间的关系 Figure 1 Relationship of N contents of feedstuffs determined by Kjeldahl method and Dumas combustion method 图2饲料含氮量的燃烧法测定值与凯氏法测定值间的差值.每个点代表一种饲料 Figure 2 Bias for the N contents of various feedstuffs detected by Kjeldahl method andDumas combustion method. Each point represents an individual feedstuff. 2.2两种方法的实验室误差 尽管杜马斯燃烧法与凯氏法的饲料含氮量测定值之间呈显著的线性相关关系，而且大部分饲料的燃烧法测定值高于凯氏法，但两种方法的分析误差大小更为人们所关心。表2列出了3个实验室分别采用凯氏法和杜马斯燃烧法测定11种样本的含氮量结果。结果表明，采用凯氏法测定时，11种饲料中有7种饲料样本的不同实验室测定值间存在显著差异 (P<0.05)，其中有2种样本的实验室测定值间变异系数大于5%(图3)；而使用杜马斯燃烧法时，只有2种样本含氮量测定值存在显著差异(P<0.05)，而且所有样本的实验室测定值间变异系数均小于5%(图3)。11种饲料样本含氮量测定值在不同实验室间的平均变异系数表现为杜马斯燃烧法(CV-1.037)明显小于(P<0.01)凯氏法(CV=3.138；图3)。这种实验室间饲料含氮量结果的差异说明，饲料含氮量的测定方法有待于进一步标准化。利用凯氏法测定时，由于其前处理过程步骤多，不同类型的消化设备、蒸馏设备、滴定仪器均会导致测定值间的显著性差异；但杜马斯燃烧法测定过程操作简单，仪器自动化程度高，测定时间短(测定全过程只需4~6分钟)，因此该方法的重现性明显优于凯氏法。 表2 凯氏法和燃烧法分别在3个不同实验室测定饲料样本含氮量(%DM)结果 Table 2 Nitrogen contents (%DM) of various feedstuffs as determined by Kjeldahl methodand Dumas combustion method in 3 laboratories respectively 饲料原料 凯氏法(Kjeldahl) 杜马斯燃烧法(Combustion) (Feedstuffs) 11 2 3 SEM P 4 5 6 SEM P 玉米秸(corn stover) 0.84b 0.88ab 0.93a 0.011 0.026 1.05 1.03 1.04 0.007 0.200 玉米青贮( Corn silage) 1.20 1.26 1.28 0.021 0.112 1.36 1.35 1.34 0.006 0.240 羊草 Chinese wild-rye grass) 0.84c 0.92b 0.95a 0.006 0.002 1.04 1.05 1.04 0.006 0.567 大豆粕Soybean meal) 7.76b 8.03a 7.96ab 0.045 0.050 8.02 8.06 8.01 0.014 0.130 DDGS 4.28 4.38 4.30 0.040 0.318 4.54 4.49 4.54 0.036 0.535 鱼粉(Fish meal) 10.73b 11.10a 10.93a 0.043 0.020 11.62a 11.36b 10.95c 0.009 0.000 酵母(Yeast) 6.96 7.10 7.18 0.044 0.079 7.18b 7.25a 7.22a 0.011 0.048 尿素(Urea) 44.40c 47.21a 46.75b 0.270 0.010 46.52 46.51 46.80 0.206 0.767 玉米(Corn) 1.44b 1.50ab 1.53a 0.013 0.044 1.53 1.57 1.56 0.009 0.106 小麦麸(Wheat bran) 2.44b 2.50a 2.44b 0.010 0.037 2.44 2.52 2.54 b 0.018 0.059 EDTA 9.37a 8.36b 9.40a 0.033 0.000 9.58 9.62 9.75a 0.035 0.082 阿拉伯字母分别代表不同的实验室。 图3凯氏法和燃烧法的变异系数。每个点代表一个样本 Figure 3 The CV values of N content determinations with Kjeldahl and Dumascombustion method. Each point represents an individual test sample. 3.结论 杜马斯燃烧法测定的反刍动物饲料含氮量结果与常规凯氏法具有高度相关性，且测定青粗饲料时其结果高于凯氏法，可能与燃烧法能够测定该饲料中硝态氮有关。对于饲料样本含氮量测定值在不同实验室之间的平均变异系数来说，凯氏法显著高于杜马斯燃烧法。与凯氏法相比，杜马斯燃烧法不仅能够在更短的时间内准确测定反刍动物饲料和饲粮总氮含量，而且还能减少对环境的污染以及对人类健康的危害。杜马斯燃烧法可以作为测定各种饲料和饲粮含氮量的常规方法。 ( 参考文献： ) ( [1] Kjeldahl J. Neue Method zur Bestimmung des Stickstoffs in Oorganischen Kkorpern[.Z Anal Chem， 1 883， 22：366~382. ) ( [2] Sweeney R A. Generi c c o mbustion method for determination of crude pr o tein in feeds： Collaborative s tudy U].JAOAC， 1989，72：770~774. ) [3] Schmitter B M， Rihs T. Evaluation of a Macrocombustion Method for Total Nitrogen Determination in FoodstuffsJ].JAgric Food Chem， 1989， 37(4)： 992~994. [4] Etheridge R D， Pesti G M， Foster E H. A comparison of nitrogen values obtained utilizing the Kjeldahl nitrogenand Dumas combustion methodologies on samples typical of an animal nutrition analytical laboratory D. AnimFeed Sci Technol， 1998， 37(1)： 21~28. [5] King-Brink M， Sebranek J G. 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