环境水中有机污染物检测方案

固相萃取-高效液相色谱法测定环境水样中的几种芳胺 摘 要:研究了用固相萃取富集和高效液相色谱法测定环境水样中的几种芳胺(苯胺、对甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、1-萘胺、2-萘胺和4-氨基联苯)的方法，环境水样中的芳胺用1-萘酚衍生生成偶氮染料，偶氮染料用Waters Sep-Pak-C18 固相萃取小柱固相萃取富集，然后以Waters XterraTMRP18(3.9×150mm, 5μm)色谱柱为固定相，82%的甲醇(内含0.01mol/L pH=8 的四氢吡咯-醋酸缓冲盐)为流动相分离，二极管阵列检测器检测测定；苯胺、对甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、4-氨基联苯、1-萘胺和2-萘胺的检测限分别为0.8、0.6、0.6、0.6、0.4 和0.4 μg/L。几种芳胺的相对标准偏差在2.1%～2.6%之间，标准回收率在93%～106%之间，方法用于环境水样中几种芳胺的测定，结果令人满意。 关键词 高效液相色谱法 固相萃取 芳胺 芳胺是一类重要的环境污染物，是环保卫生部门的重要检测指标[1,2]。芳胺的测定方法主要有光度法、电化学法、色谱法等，其中高效液相色谱法是最常用的方法。但是对于许多复杂环境样品，芳胺的含量只是微克级，而且样品中还存在大量其它有紫外吸收的物质，这些物质很难和芳胺完全分离，会干扰芳胺的测定。为了能有选择性地测定环境水样中的芳胺，研究了用1-萘酚衍生，让1-萘酚和芳胺重氮偶合生成偶氮染料，然后用固相萃取富集、高效液相色谱分离测定芳胺的方法。由于该方法采用了1-萘酚衍生，衍生反应对芳胺是特效的，且衍生后生成的几种偶氮染料最大吸收波长在460～500nm之间，该波长下样品中其它有紫外吸收的物质无吸收，不干扰芳胺的测定，方法选择性大大增加。结合固相萃取对待测组分的高倍数富集，该方法可准确测定环境样品中μg/L 级的几种主要芳胺。 1 实验部分 1.1 主要仪器和试剂 济南海能仪器股份有限公司高效液相色谱仪，包括LC7010四元泵\LC7050自动进样器，LC7060二极管阵列检测器，Hanon-Clarity色谱管理软件；苯胺、1-萘胺、2-萘胺、对甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺和4-氨基联苯标样(含量≥99%，购于Fluka 公司)，用50%乙醇-水溶液配成1.0mg/mL 的储备液，使用时用50%乙醇-水溶液稀释成1.0μg/mL 的标准工作液；1-萘酚溶液：2.0%(w/v)，用50%乙醇-水溶液配制；硫酸氢钾(KHSO4)溶液：5%(w/v)，用水配制；亚硝酸钠溶液：5%(w/v)，用水配制；氨基磺酸铵溶液：2.5%(w/v)，用水配制；氢氧化钠溶液：3mol/L，用水配制；甲醇：高效液相色谱专用(Fisher 公司生产)；实验用水为石英亚沸蒸馏水并用Milli-Q50(Millipore 公司)超纯水仪处理，电阻>18 MΩ·cm-1。 1.2 色谱条件 色谱柱为 RP18 液相色谱柱(3.9×150mm, 5μm)；固相萃取柱为C18 固相萃取小柱(填料为十八烷基键合硅胶，粒度30μm，柱腔容积为1mL，萃取容量为30mg)；流动相为82%的甲醇(内含0.01mol/L pH=8 的四氢吡咯-醋酸缓冲盐)，流速0.5mL/min；进样体积20μL。在该色谱条件下标准品和水样在480nm 波长下的色谱图见图1。 1.3 测定方法 根据样品中芳胺含量，酌情取适量水样于100mL 锥形瓶中，用5%的盐酸调节pH 至1.5～2.0(用精密pH 试纸测试)后，加入5%的亚硝酸钠溶液0.1mL，充分摇匀，放置5min；然后加入2.5%的氨基磺酸铵溶液0.5mL，充分振荡至气泡消除(消除过量亚硝酸钠的影响)，然后再加入2%的1-萘酚溶液3mL 和3mol/L 的氢氧化钠溶液2.5mL，充分摇匀，定容到100mL，该有色溶液以20mL/mim 的流速通过活化好的固相萃取小柱，过完柱后小柱上富集的待测组份用2.0mL 的乙醇以5mL/min 的流速洗脱；洗脱液用0.45μm 的针头过滤器过滤，进样20μL 分析。 2 结果与讨论 2.1 柱前衍生条件 由于复杂水样中含有大量的其它有紫外吸收的物质，如果不经衍生直接分析，样品中的芳胺无法和这些成分完全分离，会严重干扰芳胺的测定。因此采用柱前衍生的方法让芳胺生成偶氮染料，衍生反应对芳胺是特效的，而且生成的偶氮染料最大吸收波长红移到460～500nm 之间，在该波长下其它有紫外吸收的干扰组分无吸收，在色谱上不出峰，不干扰芳胺的测定，方法选择性得到很大提高。芳胺的衍生剂常用的有8-羟基喹啉、1-萘酚、邻甲氧基苯酚和N-(1-萘基)乙二胺等，对几种试剂作了比较，效果以1-萘酚最好，因此本实验选用1-萘酚作为芳胺的衍生试剂。衍生条件参照文献，芳胺先在硫氢酸钾和亚硝酸钠介质中生成重氮盐，用氨基磺酸胺分解过量的亚硝酸钠，然后在碱性条件下和1-萘酚重氮偶联即可生成偶氮染料。重氮化反应的最佳反应条件为用5%的硫酸氢钾溶液将水样pH 调节至1.5～2.0 后加入5%的亚硝酸钠溶液0.1mL，反应5min 可完全；重氮化反应完全后可和1-萘酚偶联，偶联反应的最佳条件为加入3mL 2%(w/v)的1-萘酚，在pH 8.2～13.5 范围内进行偶联，通过加入3mol/L 的氢氧化钠溶液2.5mL 控制偶联反应在该pH 范围。实验表明偶联反应瞬间可反应完全，而且生成的偶氮染料在放置10h 后吸光度不变，说明偶氮染料生成后至少可稳定10h。 2.2 固相萃取条件选择 环境水样中的芳胺含量很低，只在μg 级，不经富集很难用液相色谱法准确测定。由于用溶剂萃取法富集误差较大，操作麻烦，且易污染环境，因此本实验采用固相萃取法富集。小柱对芳胺衍生后生成的偶氮染料的固相萃取可用疏水缔合原理解释。即偶氮染料具有一定的疏水性，以水溶液通过小柱时能富集在小柱上，改用少量溶剂强度大的溶剂(乙醇、乙腈、四氢呋喃等)洗脱就能把络合物洗下而达到富集。用Waters SPE 真空提取装置，每次可同时处理20 个样，小柱活化和样品富集的流速均为20mL/min，小柱用2mL 乙醇活化，再用10mL 水洗去残留的乙醇；样品(有色溶液)以20mL/min 的流速通过小柱(厂家提供小柱对待富集物的参考萃取容量为30mg，而样品中的芳胺含量只为微克级，因此不会超过小柱的萃取容量)，通过小柱后的流出液为无色，而且收集流出液再萃取一次也未见小柱上有红色物质保留，说明一次固相萃取就能完全萃取生成的偶氮染料。样品富集完后可用洗脱剂洗脱，实验了不同洗脱剂洗脱小柱上的有色络合物，用乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、甲醇等极性有机溶剂均可使小柱上富集的偶氮染料完全洗下。在几种溶剂中由于乙醇挥发性弱、无毒且价格便宜，因此实验选用乙醇作洗脱剂，乙醇用量在2.0mL左右即可把小柱上富集的络合物完全洗下。 2.3 色谱分离条件的选择 实验表明，用82%的甲醇作流动相，六种芳胺衍生生成的偶氮染料可达到完全分离。但是，芳胺衍生生成的偶氮染料有酸式和碱式两种结构，pH≤5.4 时以酸式结构存在，为黄色，pH≥5.4时以碱式存在，为红色，碱式结构具有更高的灵敏度和更好的峰形，因此实验选择在流动相中加入0.01mol/L pH=8 的四氢吡咯-醋酸缓冲盐，保持偶氮染料在分离过程中以碱式结构存在。 2.4 色谱峰的识别和检测波长的选择 样品中各芳胺的色谱峰均由其保留时间及二极管阵列检测器400～650nm波长扫描所得光谱图与标样对照确认，并作了色谱峰纯度分辨，证明各芳胺均达到完全分离，无重叠峰，各芳胺衍生后生成的偶氮染料的吸收曲线见图2；为了获得最高灵敏度，各成分均在最大吸收波长下检测。 2.5 工作曲线 用峰面积定量法得工作曲线，进样量为20μL 时，根据信燥比S/N=3，算得各组分的检测限，结果见表1。表中A 为峰面积，C 单位为(μg/mL)。 2.6 样品分析及结果 清洁水样可直接按测定方法测定，混浊水样需用盐酸酸化后滤去悬浮物或残渣，再按测定方法测定。水样每种等量取两份，其中一份加入1μg 的苯胺、对甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、4-氨基联苯、1-萘胺、2-萘胺标样，另一份不加，按测定方法测定，每种平行测定5 次，计算5 次平行测定结果的相对标准偏差，并按加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算平均回收率，结果(扣除试剂空白)见表2。 3 结论 用1-萘酚衍生环境水样中的几种芳胺生成偶氮染料，用固相萃取富集偶氮染料，二极管阵列检测器检测测定了环境水样中的几种芳胺。由于采用了1-萘酚衍生，衍生反应对芳胺是特效的，且衍生后生成的几种偶氮染料最大吸收波长在460～500nm 之间，该波长下样品中其它有紫外吸收的物质无吸收，不干扰芳胺的测定，方法选择性大大增加。采用固相萃取富集，富集倍数可达50 倍，方法灵敏度大大提高；对于环境样品中μg/L 级的几种主要芳胺，相对标准偏差在2.1%～2.6%之间，标准回收率在93%～106%，结果满意。该方法的建立为水样中的芳胺测定提供了新方法。 PAGE - 1 -