利用UPC2对β-胡萝卜素进行定性及定量分析

「应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 Waters 利用UPC 对β-胡萝卜素进行定性及定量分析 Jacquelyn Runco， Lakshmi Subbarao， 和 Rui Chen沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德 应用优势 利用UPCTM快速分离三种最常见的类胡萝卜素的方法，可最大限度地减少类胡萝卜素的降解。 UPC方法所需分离时间仅为传统分析方法的四分之一，因此有机溶剂使用量可减少85%。 在进行目标分析时，可将在甲基叔丁基醚中萃取的β-胡萝卜素直接进样ACQUITY UPC系统进行分析， 而不需要进行耗时的蒸发及重新溶解的步骤。 沃特世解决方案 配备光电二二管阵列(PDA)检测器的ACQUITY UPC系统 MassLynx软件 ACQUITY UPCHSS CigSB色谱木 关键词 类胡萝卜素、叶黄素、β-胡萝卜素、番茄红素、脂溶性、维生素、 前言 类胡萝卜素是由植物及一些微生物合成的天然色素。对于动物以及人类而言，类胡萝卜素对于保持视力非常重要。类胡萝卜素也是一种重要的抗氧化剂，，可预防多种疾病1-2。由于类胡萝卜素不能由人类自身合成，因此人类需要通过饮食以及营养补充剂来获得类胡萝卜素。在2010年，市售类胡萝卜素的市场价值约达12亿，预计到2018年，将增长到14亿。由于许多针对营养强化食品及膳食补充剂中所添加微量元素的合规性的法律正在拟定或制定中，因此，市场上必然对能够快速、准确地分析不同产品中的类胡萝卜素含量的分析方法有更高需求。分析的速度尤其重要，因为合规性监测通常需要进行大量分析。此外，还因为许多类胡萝卜素是热敏性或光敏性的，且非常容易发生异构化以及降解。较长的分析时间将会导致定量分析结果不准确。 图1.本研究中所采用的三种类胡萝卜素的化学结构以及LogP值。 进行色谱柱筛选所采用的UPC条件 系统： ACQUITY UPC 检测器： PDA检测器 流速： 1.5mL/min 流动相A： CO， 流动相B： 乙醇 色谱柱： ACQUITY UPC BEH， CSHTM氟苯基， BEH 2-EP (3.0x100 mm， 1.7 pm)， 及HSS C18 SB (3.0x100 mm， 1.8pm) 背压： 2190 psi 样品管理器温度： 5℃ 色谱柱温度： 40℃ 样品稀释： 甲基叔丁基醚 进样量： 1pL 进样瓶： 沃特世玻璃瓶 12x32 mm 螺纹 颈瓶， 2mL PDA扫描范围： 220至600nm 数据管理： MassLynx软件 梯度： 时间(分钟)B% 0 5 5 7 55 类胡萝卜素化学结构的中心部分是含有交替排列的双键与单键的聚烯烃链，如图1所示。因此，类胡萝卜素常常显示出高度的疏水性，尤其是不含有任何杂原子的类胡萝卜素，例如番茄红素和β-胡萝卜素。配备多种吸光度检测器的高效液相色谱层析术(HPLC)是用于定性及定量检测类胡萝卜素的分析技术1-2，6-10。由于类胡萝卜素的高度疏水性，在用反相LC分离类胡萝卜素时分析时间通常较长。此外，所有的基于反相LC的方法都有类胡萝卜素在流动相中溶解度较低的问题。人们常常采用半水性或非水性的流动相来进行非水性反相(NARP)LC， 从而来减少分析时间。然而， NARP法常常会使用复杂有机溶剂的混合物作为流动相。例如，在官方发布的检测膳食补充剂和原材料中的β-胡萝卜素的AOAC法中1，使用由丁基化羟基甲苯(BHT)、异丁醇、N-乙基二异丙基胺、乙酸铵、乙腈、和甲醇组成的混合物作为流动相。 人们也常利用超临界流体色谱(SFC) 12-18来分离类胡萝卜素12。 SFC以CO2为主要流动相，其对类胡萝卜素具有超强的溶解力，能够增强类胡萝卜素与流动相之间的非极性作用，因此能够减少保留时间"。除了由于CO2的高扩散性所导致的高效保留力，SFC所采用的较温和的温度也是该方法的一大优点，较温和的温度能够避免类胡萝卜素受热发生降解。 超高效合相色谱(UPC)是分离科学的一个新类别，结合了SFC及UPLC技术的优点。除了保留SFC法的基本精髓外， UPC法所使用的系统体积较UPLC更少，且更重要的，它所采用的填充有亚-2-um颗粒的色谱柱具有超强分离能力，因此能够大大减少分离时间、提高溶离效率以及检测时的灵敏度。 在本应用纪要中，我们阐述了利用UPC在2分钟内分离三种常见类胡萝卜素的方法，也阐述了对β-胡萝卜素膳食补充胶囊所进行的定量分析。 实验β-胡萝卜素萃取物分析所采用的优化的UPC条件流速 1.5 mL/min流动相： 75：25CO2/乙醇(等度)色谱柱： ACQUITY UPCHSS C18SB 3.0x100mm，1.8um背压： 2190 psi样品管理器温度： 5℃色谱柱温度： 40℃样品稀释： 甲基叔丁基醚进样量： TpL进样瓶： 沃特世玻璃瓶12x32mm螺纹颈瓶，292mLPDA扫描范围： 350至600nm波长补偿： 440nm，以550至600nm波长为对照 样品描述 所有的样品制备步骤均在光线柔和的环境中进行。为了筛选色谱柱以及后续的优化，分别将1mg叶黄素、 β-胡萝卜素、及番茄红素溶解到10mL甲基叔丁基醚(MTBE)中，分别制得浓度为0.1 mg/mL的母液。 校正曲线：制备β-胡萝卜素母液(0.1 mg/mL的甲基叔丁基醚溶液)的系列浓度的稀释液。取每一浓度的三次进样峰面积平均值作为各浓度的数据点。 胶囊分析：将三枚标示15 mg/个胶囊的β-胡萝卜素胶囊切开，并将内容物溶解于250mLMTBE中，轻轻搅拌。取六份样本，进样，并取峰面积的平均值，计算出胶囊中的β-胡萝卜素含量。 结果与讨论 叶黄素、番茄红素、及β-胡萝卜素是北美人饮食中最常见的三种类胡萝卜素。经过初步筛选，发现采用甲醇作为流动相B(共溶剂)会导致峰形不佳，这是由于类胡萝卜素在甲醇中溶解度较低；而采用异丙醇作为共溶剂则会导致形成较宽的波峰。因此本实验中，均采用乙醇作为共溶剂。图2显示了由管柱筛选实验所得的类胡萝卜素混合物的UPC/UV色谱图。通过进样各种标准品并在相同条件下进行色谱分离，确定各峰所对应的化合物名称。 ACQUITY UPCC18SB色谱柱可初步分离三种类胡萝卜素，采用另一种极性更弱的色谱柱--CSH氟苯基，则可将番茄红素和β-胡萝卜素进行部分分离。若采用BEH用BEH2-乙基吡啶色谱柱则不能将番茄红素和β-胡萝卜素分离。虽然番茄红素和β-胡萝卜素的结构和极性相近，但ACQUITY UPCC18 SB固定相上的十八烷基碳链可有效地将UPC中的两种分析物进行分离。 图2.采用下列几种不同的色谱柱，将番茄红素、β-胡萝卜素及叶黄素混合物进行分离时所产生的UPC泊/UV色谱图： (A) HSS C18 SB， (B) CSH Fluoro-Phenyl， (C) BEH 2-EP， 及(D) BEH。波峰所对应的化合物名称如下：1.番茄红素，22.β-胡萝卜素，及3.叶黄素。 图3.采用ACQUITY UPC?HSS C18SB色谱柱，在如下所示的不同梯度/等梯度条件下进行色谱分离所得的UPC2/UV色谱图：(A)开始时的筛选条件：在5分钟内从5%变化至20%，(B)在0.5分钟内从20%变化至30%，及(C)25%等梯度。波峰所对应的化合物名称如下：1.番茄红素，2.-胡萝卜素，及3.叶黄素。 随后进行优化，以缩短运行时间。采用20% B/min(如图3B所示)以及等梯度25%B(如图3C所示)，均能够在2分钟内将全部三种类胡萝卜素进行充分分离。由等梯度方法所获得的最后一个色谱峰(叶黄素)比由梯度方法所获得的稍宽，但由等梯度方法所产生的基线较为光滑，这可能有益于在分析物含量较低的情况下进行检测。因此，决定选用等梯度方法，以保证可进行定量分析。优化后的方法所需运行时间只有传统方法的四分之一5。因此，有机溶剂消耗量减少约85%。另外，采用C18色谱柱，非性性分析物在流动相中的溶解度增加，从而保留减弱了，例如胡萝卜素。由于非极性分析物在压缩CO2中溶解度较好，因此，在进行类胡萝卜素分析时，采用UPC分析要比采用RPLC更快、更好。 图4.在优化的色谱分离条件下，三种类胡萝卜素的UPC²色谱图：：((A)β-胡萝卜素标准品，(B)β-胡萝卜素胶囊，及(C)三种类胡萝卜素的混合物。 为了进行定量分析，将市售β-胡萝卜素胶囊切开，并将内容物溶解到甲基叔丁基醚，随后将所得溶液直接进样到系统中，采用如图3C所示的优化方法进行分析。所得β-胡萝卜素色谱图示例如图4B所示。样品制备步骤简单是使用UPC 进行低极性样本分析的另一个优点。在溶解低极性样品时，通常需要使用低极性溶剂，例如甲基叔丁基醚及己烷，这些溶剂都与UPC相容。而RPLC法则需要要溶解在低极性有机溶剂中的样品首先进行蒸发处理，然后将其溶解到适宜溶液中再进行分析。 图5是浓度从0.0001到0.1 mg/mL的β-胡萝卜素甲基叔丁基醚溶液的校正曲线。其线性范围可跨三个数量级， 且R>0.99。检测下限(LOD，定义为S/N>3)，及定量下限(LOQ，定义为S/N>10)分别为50与100 ng/mL。这些数值与HPLC法相当或更好58.该方法所具有的较高的检测灵敏度可部分归因于UPC与胡萝卜素分析相容。CO2与B-胡萝卜素之间的非极性相互作用极大地减少了β-胡萝卜素的滞留时间，从而使得溶离峰更早出现，且峰形更尖，因而检测灵敏度更高。 图5浓度为0.0001至0.1 mg/mL的β-胡萝卜素MTBE校正曲线。 表1及表2概括说明了β-胡萝卜素胶囊的分析结果。利用该分析法所得的保留时间以及峰面积的再现性均较好。比对胶囊标签，发现该分析法的准确性也较好。样品制备方法也非常简单、直接。利用UPC可快速、高重现性地进行色谱分析。 进样 峰面积 保留时间(min) 1 10348 0.91 2 10291 0.91 3 10382 0.91 4 10330 0.91 5 10313 0.91 6 10293 0.91 平均值 10326.17 0.91 RSD% 0.34 0 表1.六次进样的再现性(β-胡萝卜素胶囊)。 标签：15mg/个胶囊 第1次分析 第2次分析 第3次分析 平均值 RSD% mg/个胶囊 15.13 15.39 15.24 15.25 0.84% 表2.三枚胶囊中的β-胡萝卜素含量。 结论 已成功开发出可在两分钟时间内将三种最常见的类胡萝卜素进行分离的UPC方法。该方法所需时间是传统分析方法的四分之一，因此能够将有机溶剂用量减少高达85%。较短的分析时间亦将分析物可能在色谱柱上发生降解的风险降到最低。分析速度加快是由于UPC适用于低极性分析物分析。UPC 法采用乙醇作为共溶剂，而不使用在HPLC方法中常用的有机溶剂混合物。因此， UPC法是一种更为环保的方法。 已开发出可在1.5分钟内对膳食补充胶囊中的β-胡萝卜素进行定量分析的方法。其动态范围可跨三个数量级，且LOD及LOQ分别为50 ng/mL 及100 ng/mL。 采用甲基叔丁基醚作为萃取溶剂，所得的β-胡萝卜素萃取溶液可直接进样到ACQUITY UPC系统进行分析，而不需要进行较耗时的蒸发和重新溶解步骤(在反相LC方法中常常需要进行这些步骤)。采用该方法对膳食补充胶囊进行分析时，再现性与精确性也较好。高通量的UPC法适用于常常需要进行大量分析的实验室常规质量控制与质量监测。 ( 参考文献 ) ( 1. 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