营养保健品中维生素K1检测方案(液相色谱仪)

[应用纪要] 使用配备C色谱柱的超高效合相色谱快速分离营养保健品中的维生素K，异构体和维生素K， Jinchuan Yang 应用优势 在3min内快速可靠地分离维生素K反式和顺式异构体以及MK-4。 使用Cg色谱柱即可实现分离；无需使用特殊的Cgo色谱柱。 以二氧化碳作为主要流动相，将有机溶剂弃置率降到最低。 沃特世解决方案 配备ACQUITY UPC²PDA检测器的ACQUITY UPC系统 ACQUITY UPCHSS C8SB色谱柱 Empower3 CDS软件 关键词 维生素K异构体，叶绿醌，甲基萘醌， 四烯甲萘醌， MK-4， UPC 简介 维生素K(叶绿醌)是一种人体必需的营养成分，主要由植物(尤其是绿叶蔬菜)产生。天然产物中的维生素K主要以反式结构存在，而膳食补充剂通常使用合成的维生素K，其中可能含有相当数量的顺式结构。反式维生素K具有生物活性，而顺式K，并不具备。我们迫切需要一种能够分离反式和顺式维生素K异构体的方法，以便真正地评估补充剂成分的营养价值。目前用于分离维生素K，异构体的HPLC方法需要使用C色谱柱。HPLC方法的典型运行时间大约为20 min， 并且有些方法还需要使用氯化溶剂。1-3 超高效合相色谱(UltraPerformance Convergence Chromatography"， UPC)是一种分离技术，它利用压缩CO，处于或接近超临界状态时的特有属性(即低粘度和高扩散性)以及亚2um颗粒填充色谱柱，显著提高了分离效率、速度和选择性。本应用纪要介绍了一种快速分离维生素K反式和顺式异构体以及四烯甲萘醌(MK-4，维生素K，的一种常见形式)的方法，该方法使用UPC和ACQUITY UPC HSS Cig SB色谱柱， 在3 min内即可完成分离。维生素K，异构体和MK-4的结构如图1所示。与目前所使用的基于LC的维生素K反式和顺式异构体分析方法比相比，此UPC方法更加快速、简单(无需使用Cs色谱柱))，并且所消耗的有机溶剂更少。 图1.反式和顺式维生素K，以及四烯甲萘醌的结构。 实验 样品制备 称取维生素K， (Sigma-Aldrich)和MK-4 (Sigma-Aldrich)，溶于异辛烷 (ReagentPlus， Sigma-Aldrich)中，配制成1 mg/mL的储液。中间体和工作标准溶液通过用异辛烷连续稀释储液获得。维生素K补充片剂购自本地商店，将其研磨成粉后用异辛烷提取。用0.45 um PTFE注射式过滤器过滤上清液，稀释后进样。 条件 UPC条件 系统： 配备ACQUITY UPCPDA 检测器的ACQUITY UPC软件：Empower 3检测条件：UV， 243 nm(补偿参比400至500 nm，分辨率6nm)色谱柱：ACQUITY UPC’HSSCSB3.0×100 mm， 1.8 um柱温：50℃样品温度：10℃进样体积：20 uL(满定量环)流速：3.00 mL/min流动相A：CO，流动相B：乙腈/甲醇混合物(50/50v/v)运行时间：4 minABPR压力：1500 psi梯度：流动相B在0.5%保持2 min，在1.5min内增加至20%，以20%B保持0.5 min 结果与讨论 使用UPC和单个UPCHSS CIg SB色谱柱(3.0×100 mm， 1.8 pm) 在3 min内实现了维生素K，顺式和反式异构体以及MK-4的基线分离。如图2所示，顺式结构的维生素K首先被洗脱，接着是反式结构，最后是MK-4。关键对(顺式和反式维生素K)之间的USP分离度为1.7(表1)).。在梯度程序中，在0.5%B中初始2min的等度洗脱对于顺式和反式维生素K的基线分离是非常必要的。将流动相B的输送体积精确控制在0.5%对于关键对的分离至关重要。ACQUITY UPC 系统是目前市场上唯一能够提供这种水平的精确控制的SFC系统。等度保持阶段之后，本研究采用了流动相B从0.5%增加至20%的通用梯度。此梯度范围可在应用中根据实际的目标维生素K，同系物的保留时间作出相应的修改。本研究还涉及MK-4，因为它是维生素K，的一种常见形式，并且是与维生素K结构最相近的一种维生素Kz。其它形式的维生素Kz(如MK-7)具有较长的侧链，在色谱柱上的保留时间更长。因此它们能够很容易地与维生素K分离。总运行时间为4 min， 比使用Cgo色谱柱的HPLC方法的典型运行时间至少快五倍。每一次进样的有机溶剂消耗量少于1 mL，这只是使用LC方法时典型溶剂用量(15至30mL)的一小部分。 图2.维生素K，异构体和MK-4混合标准品的叠加色谱图 (n=10)。 RT RT 峰面积 分离度 分离度 (min) RSD RSD RSD 顺式维生素K1 2.553 0.08% 0.6% 一 一 反式维生素K1 2.636 0.05% 0.2% 1.7 1.1% MK-4 2.710 0.05% 0.2% 2.0 0.9% 表1.维生素K混合标准品的重复分析结果(n=10)。 混合标准品的十次重复分析表现出优异的重复性(表1)。信噪比为10时，顺式维生素K、反式维生素K 和MK-4的定量限((LOQ)分别为0.06、0.06和0.04 ug/mL (表2)。这些化合物都获得了良好的线性 (R>0.998)(表2)。市售维生素K补充剂的分析也表现出良好的重复性和分离度(图3)。经测定，在这种产品中，顺式K1占总维生素K，的11.2%(表3) 参数 顺式维生素K 反式维生素K MK-4 浓度范围1\ (ug/mL) 0.03-1.5 0.02-8.5 0.02-10 线性回归(R) 0.9980 0.9997 0.9999 斜率 (mV sec mL/ug) 17.7 16.3 16.0 LOQ (ug/mL) 0.06 0.06 0.04 图3.维生素K片剂重复分析的叠加色谱图 (n=3)。 保留时间 浓度 平均值 RSD 平均值 RSD 占总K的 (Min) (%) (ug/mL) (%) 百分比浓度 顺式维生素K 2.558 0.09 0.38 2.1 11.2 反式维生素K 2.638 0.06 3.20 0.3 88.8 表3.维生素K补充片剂的重复分析结果(n=3)。 利用UPC技术，可在3min内使用ACQUITY UPC HSS Cig SB色谱柱快速分离顺式和反式维生素1异构体及MK-4。分析速度比目前所使用的HPLC方法快至少五倍，并且无需使用特殊的Co色谱柱。此UPC方法具有出色的分离选择性、分离度、灵敏度和重复性，而且所使用的溶剂远远少于HPLC方法。，LUPC可以用于食品成分检测实验室的常规维生素K分析，它能提高实验室通量、降低运行成本。 ( 参考文献 ) ( 1. AOAC Official M e thod 99 9 .15 Vitamin K in m i lk and i nfant form u las liquidchromatographic method.AOAC International. 2005. ) ( 2. Woollard DC， Indyk HE， Fong BY， Cook K K . Determination o f vitamin K1 i s omers i n foods by l iquid chromatography with C3o bonded-phase col u mn.J AO A C International 85(3)：682-691.2002. ) ( 3 . Huang B， Zheng F， Fu S， Y a o J， T ao B， Ren Y . U P LC-ESI-MS/MS for determining trans- a nd cis-vitamin K， i n infant formulas： method and a p plications. E ur F ood Res Technol.； 235(5)：873-879.Nov. 2 01 2 . ) ( 4. A ubin A . A n alysis of fat-soluble v i tamin capsules using UltraPerformance Conv e rgenceChromatography. W a ters A p plic a tion No te N o . 7 2 0004394en. June ， 2012. ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters， UPC， Empower和The Science of What's Possible是沃特世公司的注册商标。 UltraPerformance Convergence Chromatography是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 上海：021-61562666 免费售后服务热线：800(400)8202676WWw.waters.com 快速分离营养保健品中的维生素K，异构体和维生素K， 快速分离营养保健品中的维生素K，异构体和维生素K， 反式维生素K1具有生物活性，而顺式K1并不具备。分析人员迫切需要一种能够分离反式和顺式维生素K1异构体的方法，以便真正地评估补充剂成分的营养价值。目前用于分离维生素K1异构体的HPLC方法需要使用C30色谱柱。HPLC方法的典型运行时间大约为20 min，并且有些方法还需要使用氯化溶剂。利用UPC2技术，可在3 min内使用ACQUITY UPC2 HSS C18 SB色谱柱快速分离顺式和反式维生素1异构体及MK-4。分析速度比目前所使用的HPLC方法快至少五倍，并且无需使用特殊的C30色谱柱。