黑米中天然色素检测方案

微波萃取黑米天然色素的初步研究 史克景，夏春镗 同济大学生命科学与技术学院 上海200433 摘要：采用了近年来一种新型的对天然产物萃取技术一微波萃取，对黑米天然色素进行萃取研究，同时与萃取黑米天然色素的常规方法之一水萃取法做比较研究。经对比，两种方法萃取黑米天然色素在可见光波段的吸收峰位置一样及其在可见光波段的主要成份是同一种物质，经化学性质测定两种提取方法所得物表现出高度的一致性。微波萃取萃取速率以及萃取率比水萃取法高，所以本文的研究具有很高的应用价值。 关键词：天然色素 微波萃取 吸光度 中图分类号 文献标识码 文章编号 收稿日期 作者简介： A Primary Research on the Extraction Black Rice Natural Pigment With Microwave Shi Ke-jingg2Xia Chun-tang (TONGJI University Biomedical Engineering Shanghai 200433) Abstract： A newly technique -microwave extraction was adopted to study black rice natural pigment.Meanwhile we compared with the groovy way-water extraction.It studied that whenever using which way canthe situation of absorbency apex get the seam main material in the visible light wave band. What the two ways gotwas coherence highly by chemistry character detemination. Microwave extraction can improve the extractionvelocity remarkably and can the extraction rate. So the study had high application value. Key word： natural pigment ； microwave extraction ； absorbency 1引言 黑米是特种稻米中重要成员之一，也是我国珍贵的油粮作物资源之一。它具有黑色的外表，含有其它大米所没有的Vc等，含Zn量是普通大米的2~4倍；含Fe量是普通大米的5~7倍；具有较高的必需氨基酸含量，某些黑米还含有被称为“抗癌营养剂”的硒11-4]。大量的研究结果表明，黑米色素为花青苷类色素，具有降低冠心病发病率，改善视敏度，抗氧化和抗癌活性等功能5-7。因而研究和开发利用黑米天然色素有着良好的发展前景。 目前有关黑米天然色素的常规萃取已有很多报道18~14]。大多数都是采用传统溶剂萃取如王学增用纯甲醇作提取溶剂15，16，提取收率为1.7%左右。谢笔钧等16.用pH=3的60%乙醇溶液浸提，得到黑米色素粗品，提取率为3.4%左右。王学增等15.采用碱溶酸沉法从和黑米中提取黑米色素。这些方法大都存在着萃取速率和萃取率低等缺点。为此，本文采用在电磁波能量场中提取的一种新型方法一微波萃取。比较了微波萃取和常规萃取的萃取速率及其萃取率；同时对其萃取物的性质进行比较研究。 2材料、试剂与仪器 2.1主要材料 黑米：：“乌贡二号”黑糙米(上海交通大学农业和生物学院提供)。 2.2实验试剂 柠檬酸、柠檬酸钠、H202、NazSO3、苯甲酸钠、抗坏血酸、蔗糖、葡萄糖、AgNO3、NaCl、Zn (NO3)2·7H2O、FeCl2·4H2O、SnCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、Fe (NO3)3·9H2O、AlCl3·6H2O均为分析纯。 2.3仪器 721分光光度计 1cm 比色皿(上海第三分析仪器厂)、HHS电热恒温水浴锅(上海沪南科学仪器联营厂)、MD 110-2精密电子天平(上海天平厂)、WX-3000 微波快速消解系统(上海屹尧仪器有限公司)。 3 实验内容 3.1黑米天然色素的可见光谱测定 以水溶液作为空白，用分光光度计测定两种方法萃取的黑米天然色素在 440~600nm的吸收光谱，并确定最大吸收波长。 3.2定温下传统萃取黑米天然色素 准确称取 1g黑糙米五份，量取pH=3.0的 0.1M柠檬酸~0.1M柠檬酸钠缓冲溶液 50ml六份于 100ml的锥形瓶中，在60℃的水浴中分别加热20 min， 40 min， 60 min， 80min， 100 min， 120min， 将萃取液过滤，定容至100ml的容量瓶中。测定吸光度，确定其最佳萃取时间和萃取率，以色价来衡量萃取率。其中色价的测定方法为[I71：每次提取完毕后的提取液，过滤后定容至100ml，然后再稀释至上机测定的浓度。测定时的光程为 1cm， 以空白溶液作参比，在最大吸收波长处测定吸收值A。样品的色价按下式计算：E=A*R(E为色价，A为最大吸收值，R为 100ml浸提液稀释至测定前的倍数)。 3.3定温下微波萃取黑米天然色素 准确取 1g黑糙米七份，均分到三个微波萃取罐中，移取 pH=3.0 的 0.1M柠檬酸~0.1M柠檬酸钠缓冲溶液16ml、16ml、18ml分别于温度罐、普通罐和压力罐中。设定微波条件为：温度80℃、功率500W，在WX-3000型微波炉中分别加热 100s、150s、200s、250s、300s、350s、400s，待反应结束后冷却、过滤，定容至100ml的容量瓶中。测定吸光度计算色价，并确定最佳萃取时间。 3.4常规萃取与微波萃取所提取的黑米天然色素的性质试验对比 用 pH3.0的0.1M 柠檬酸~0.1M柠檬酸钠缓冲溶液萃取黑米天然色素。本试验采用黑米：pH3.0缓冲溶液以 1g ： 50ml 的比例，分别以60℃用常规萃取与80℃微波萃取黑米天然色素，萃取时间为各自在该温度下的最佳萃取时间。将每次制备液合并，置于4℃冰箱中保存备用。取同体积的两种方法的萃取液，在440~600nm范围内的吸光度，确定两种方法萃取液的最大吸收波长以及色价。 3.4.1氧化还原剂对两种萃取物的影响 3.4.1.1氧化剂对两种萃取物的影响对照 分别移取两种不同方法萃取的黑米天然色素溶液两组，每组各六份共12份，每份20ml，置于50ml的锥形瓶中，加入H2O2使溶液浓度(W/V)分别为：0、0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、2.0%；将两组溶液在暗厨里放置1h、5h、9h后，测定溶液在入max的吸收值。 3.4.1.2还原剂对两种萃取物的影响对照 分别移取两种不同方法萃取的黑米天然色素溶液两组，每组各六份共12份，每份20ml，置于50ml的锥形瓶中，加入Na2SO3使溶液浓度(W/V)分别为：0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L，将两组溶液在暗厨里放置1h、5h、9h后，测定溶液在 入 max的吸收值。 3.4.2常用添加剂对两种萃取物影响的对照 分别移取两种不同方法萃取的黑米天然色素溶液两组各六份于12个25ml的容量瓶中，加柠檬酸使每组溶液中柠檬酸的浓度(W/V)分别为：0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，将两组溶液在暗厨里放置 1h 后，测定溶液在入 max 的吸收值。 同样，加苯甲酸钠使每组溶液中的浓度(W/V)为：0、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%。加抗坏血酸使每组溶液中的浓度(W/V)为：0、0.04%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%，分别将两组溶液在暗厨里放置1h后，测定溶液在入 max 的吸收值。 分别移取两种不同方法萃取的黑米天然色素溶液两组各五份于10个25ml的容量瓶中，加蔗糖使每组溶液中蔗糖浓度(W/V)分别为：0、2.5%、5.0%、10.0%、15.0%，将两组溶液在暗厨里放置 1h 后，测定溶液在入 max 的吸收值。同样，加葡萄糖使每组溶液中的葡萄糖的浓度(W/V)为：0、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%，将两组溶液在暗厨里放置 1h后，测定溶液在 入 max 的吸收值。 3.4.3金属离子对两种萃取物影响的对照 分别移取两种不同方法萃取的黑米天然色素两组各四份，置于 50ml的锥形瓶中，加入AgNO3，使每组浓度(mM/V)分别为10.0mmol/L，在暗厨内放置 1h后测定在可见光波段的吸收光谱的最大吸收峰及其 入 max变化。以同样的步骤测定加入NaC1、Zn(NO3)27H2O、FeCl2·4H2O、SnCl2 ·2H2O、MgSO4 7H2O、Fe(NO3)3 9H2O、AlCl； 6H20的可见光波段的吸收光谱。 4结果与讨论 4.1两种萃取物的最大吸收波长和最佳萃取时间的确定 图1为常规萃取和微波萃取的黑米天 然色素溶液在440nm~600nm范围内的吸收光谱。从图中可以得出，两种萃取方法所得的色素的最大吸收均为 515nm 处，其中微波萃取的吸收值比常规萃取略大。 图1两种萃取方法的光谱曲线 Fig.1 Spectrum curves of two extraction ways 图2和3为常规萃取与微波萃取的时间与吸收值的关系。从图2可以得知，水提法在60~100min 的萃取量变化不大，而小于60min 和大于 100min 时吸光度下降。因此，水提法的最佳萃取时间为60min。从图3可以得知，在设定的条件下微波萃取在 250s时吸光度最大，随着时间的增加，萃取黑米天然色素的吸光度下降，所以微波萃取以250s 为最佳萃取时间。称取同样重量的黑 图2 常规萃取中时间与吸光度的关系 Fig.2 The relation of time and absorbencyOf common extraction 图3 微波萃取中时间与吸光值的关系 Fig.3 The relation of time and absorbencyOf microwave extraction 米，水萃取 60min 的色价 E=0.246*(25/8)=0.769，而微波萃取250s的色价 E=0.301*(25/8)=0.941。所以，采用微波萃取黑米天然色素，不仅大大的缩短萃取时间，而且能够显著提高萃取率。 4.2不同浓度的氧化还原剂对黑米天然色素的影响 由图4，，黑米天然色素在浓度(W/W) 图4氧化剂对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.4 Effect of oxidant to black natural pigment ofextraction with different ways 0.2%~2.0%的H2O2中吸光度有变化，并呈减少趋势，而放置时间无论是1h， 5h 或 9h 差异不明显。常规萃取与微波萃取所得黑米天然色素之间的差异较明显。因此，常规提取和微波萃取的黑米天然色素对氧化剂都不稳定。 图5 还原剂对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.5 Effect of reducer to black natural pigmentof extraction with different ways 由图5得出，两种方法萃取的黑米天然色素在浓度(W/W)为 0.01%~0.05%的NazSO3中吸光度均表现出逐渐减少的趋势，且色素的残留量随时间的延长逐渐减少。所以在色素使用活保存中禁止与强氧化剂或强还原剂接触。氧化还原剂对常规萃取和微波萃取两种方法的萃取物的影响是一致的。 4.3常用食品添加物对黑米天然色素影响 图 6、图7、图8、图9和图10分别描述了不同浓度(W/V)的食品添加剂苯甲酸钠、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸和抗坏血酸对采 用两种不同方法萃取的黑米天然色素的作用。由图6可知，随着苯甲酸钠浓度的增加，两种方法萃取的黑米天然色素吸光度降低；添加柠檬酸使两种方法萃取的色素的吸光度都增大(如图9所示)，而添加葡萄糖、蔗糖和抗坏血酸(如图7、8和图10所示)，随着浓度的增大色素的吸光度稍稍增大，但是幅度增加不大。这说明除苯甲酸钠外，其他四种添加物可以使黑米天然色素的稳定 图6苯甲酸钠对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.6 Effect of sodium benzoate to black natural pigmentof extraction with different ways 图7葡萄糖对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.7 Effect of glucose to black natural pigmentof extraction with different ways 图8蔗糖对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.8 Effect of sucrose to black natural pigmentof extraction with different ways 图9柠檬酸对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.9 Effect of citric acid to black natural pigmentof extraction with different ways 图10抗坏血酸对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.10 Effect of ascorbic acid to black natural pigmentof extraction with different ways 性提高，而苯甲酸钠则使黑米天然色素的稳定性降低。本试验的对照图中可以看出：在不同添加物的影响下，微波萃取物和常规萃取物的吸收曲线增减趋势是一致的，且微波萃取色素的吸光度始终高于水萃取色素。 4.4 金属离子对两种萃取物的影响 4.4.1同一浓度下不同金属离子对两种不同方法萃取的黑米天然色素的影响 图11和12表明添加金属离子后最大吸收值和最大吸收波长略有些变化，(1~8分别为Ag*、Nat、Zn+、Fe+、Sn?+、Mg+、Fe、Al+，0为对照样品)。从图12中可以看出， 图11金属离子对不同方法萃取黑米天然色素的影响 Fig.11 Effect of metal ions to black natural pigmentof extraction with different ways 图12金属离子对不同方法萃取黑米天然色素最大吸收波长的影响 Fig.12 Effect of metal ions to wavelength of black natural pigment of extraction with different ways与对照样品比较， Fe+和Al+使色素的吸收波长蓝移较为明显， Sn²+使色素的吸收波长红移较为明显。从图11可以看出，常规萃取和微波萃取都有： Al+、Mg2+、Zn²+、Na*、Ag*使色素的吸收值增大；而Fe+、Fe²+、Sn²使色素的吸收值减小。其中Al+使色素的吸收值增大较为明显， Sn²+和Fe+使色素 的吸收值降低较为明显。所以在黑米天然色素的使用和保存中，应避免使用铁制或锡制容器保存。 5结论 微波萃取和常规萃取两种方法的研究表明，在本实验设定的条件下微波萃取的最佳时间为250s，常规萃取的最佳时间为 60min，其中微波萃取的色价显著高于常规萃取，两种萃取方法的最大吸收波长均为515nm。通过两者萃取物性质的比较研究可以看出，用两种不同方法萃取的黑米天然色素对氧化还原剂、食品添加剂以及部分金属离子其作用基本相同。 综上，用微波萃取黑米天然色素应是一种可行的方法，而且具有色价高(即提取率高)萃取时间短等明显的优势。 ( 吴三桥，李新生，闵锁田等.黑米红色素系列产品的开发研究[].汉中师范学院学报(自然科 学)，1997，15(2)：67~69. ) ( 2 李新生，吴升华.陕西黑稻资源及其开发利用[J].资源科学1998，20(6 ) ：67~73. ) ( 张名位.特种稻米及其加工技术[M].北京：中国轻工业出版社2000：42一145. ) ( 4 高如嵩.陕西黑米的主要营养成分及其营养特征[J].西北农学院学报.1984，6(1)：97一101. ) ( 5 Timberlake， C， F et al. Anthocyanins a s natural food colorants [J].Prog.Clin.Biol.Res.1988，280：107~121. ) ( 6 Wang， H.et al. Oxygen r a dical absorbing c a pacity of anthocyanins []. J.Agric.Good Chem.1997， 45：304~309. ) ( 7 Kamei， H.et al. Supperssion o f t umor cell growth by anthocyanins v i tro []. Cancer Invest.1995， 13：590- 594. ) ( 8 张名位，彭仲明，徐巨明.黑米色素的分布及性质研究[C].上海：上海科技教育出版社，1992：413—418. ) ( C 李新生，吴三桥，张鑫科.黑精米与黑米糠中矿质及微量营养元素分析[J].汉中师范学院学报，1997， 15(2)：67—69. ) ( 10 吴三桥，史隋孝，丁锐，李新生，等.黑米中花青苷色素的测定方法的研究.氨基酸和生物资源[].2002， 24(3)：66—68. ) ( 11 闵锁田，吴 三 桥，李新生，等.金属离子对黑米花青苷色素吸收光谱的影响[J].氨基酸和生物资 源，2001，23(4)：4—7. ) ( 12 吴三 桥 ，闵锁田，李新生，等.黑米皮花青苷色素测定方法的研究[].氨基酸和生物资源，2001，23(4)：44一46. ) ( 13 赵则胜，赖来展，郑金贵.中国特种稻[M].上海：上海科学技术出版社，1995：44一49. ) ( 14 Wang， H.et al. Oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins [J ] .J.Agric.Food Chem.1997，45(1)：304309 ) ( 15 王学增等.黑米天然色素研究.食品科学，1993，6：13一17. ) ( 16 谢笔钧等.黑米微量元素Fe、Zn、Cn 和黑米色素的研究.食品科学，1993，6：1719. ) ( 17 隋晓.辣椒红色素晶体制备技术的研究.精细化工，1999，16(4)：22一24. )