谷氨酰胺合成酶(GS)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060705345759927](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060705345759927.png)
溶液的配制:
试剂三:用时每瓶加入 5mL 蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃分装保存。
产品说明:
GS(EC 6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。
GS在ATP和Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下与铁形成红色的络合物;该络合物在540nm处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、 血清(浆)样品:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 在EP管中加入下列试剂:
![image 2022060705354354318](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060705354354318.png)
混匀,静置 10min 后,5000g,常温离心 10min,取 200μL 上清液至微量玻璃比色皿或 96 孔板中,测定 540nm处的吸光值 A。ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
三、GS活力单位的计算
![image 2022060705360703499](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060705360703499.png)
V反总:反应体系总体积,400μL=0.4mL;V样:加入样本体积,70μL=0.07mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
注意事项:
试剂一、试剂二可能会有析出,可以重悬后使用,反应后取上清测定。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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