土壤几丁质酶检测试剂盒微量法 微量法

土壤几丁质酶活性检测试剂盒说明书

 微量法

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：自备甲苯溶液。

2、 试剂三：悬浊液，使用前摇匀。

3、 试剂五：临用前在 1 瓶试剂五 A 中加入 12mL 试剂五 B，充分溶解，现配现用。

4、 标准液：5mg N-乙酰氨基葡萄糖。临用前加入 1mL 试剂二配制成 5mg/mL 的标准溶液，即 5000μg/mL 的标准溶液。

产品说明：

几丁质来源非常丰富，是自然界中仅次于纤维素的第二大类生物高聚物，由于其分解非常缓慢而大量堆积容易造成环境严重污染。几丁质酶是影响土壤中氮矿化的一种重要的酶，其分解几丁质控制着氮循环的关键步骤。

几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖与碱共热产生的中间化合物可进一步与对二甲氨基苯甲醛反应产生显色物质，该显色物质在 585nm 处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、可调式移液器、振荡器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、30-50目筛、蒸馏水与甲苯。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

新鲜土样风干，过 30-50 目筛。 称取约 0.1g 土样，加入 0.05mL 试剂一，混匀，常温静置 15min。静置结束后，加入 0.2mL 试剂二与 0.4mL 试剂三，37℃振荡反应 24h，8000rpm，4℃离心 10min（若离心后上清中仍有杂质，建议将上清再次离心，至澄清），取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 585nm，蒸馏水调零。

2、 标准品溶液的配制：临用前将 5000μg/mL 的标准溶液用试剂二稀释 80 倍至 62.5 μg/mL 标准溶液备用。

3、 在 EP 管中进行以下操作：

三、土壤几丁质酶活性计算

酶活性定义：37℃条件下，每克土壤每天分解几丁质产生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

土壤几丁质酶活性（U/g 土样）=（ΔA÷ΔA 标准×C 标）×V 反总÷W÷T=40.625×ΔA÷ΔA 标准÷W

C 标：标准管的浓度，62.5μg/mL；V 反总：样本处理总体积，0.65mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1d。

注意事项：

1. 反应结束后立即进行比色。

2. 试剂四刚从低温（4℃）条件取出会有晶体析出，加热使其溶解即可。

3. 试剂五有一定的毒性，试验操作时做好个人防护。

4. 当 A 测定大于 1 时，建议将样本上清液用试剂二稀释后再进行测定。

实验实例：

1、 取 0.1g 土样 1 按照测定步骤操作，用 96 孔板测得数据后计算 ΔA=A 测定-A 对照=0.098-0.051=0.047，ΔA 标准=A 标准- A 空白=0.612-0.049=0.563。根据公式计算酶活得：

土壤几丁质酶活性（U/g 土样）=40.625×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W= 40.625×0.047÷0.563÷0.1=33.9 U/g 土样。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！