淀粉脱分支酶活性检测试剂盒 微量法

淀粉脱分支酶（DBE）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意:本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取 1 支加入 1.5 mL 试剂一，充分溶解后待用，用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；

2、 标准品：10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解，配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用，2-8℃可保存两周；

产品说明：

淀粉脱分支酶（starch debranching enzyme，DBE）能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键，对淀粉的结构起“修饰”的作用，淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用，淀粉分支酶和淀粉脱分支酶的平衡使得支链淀粉合成。

DBE催化支链淀粉产生还原糖，其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质，通过测定其在540nm下吸光值变化可计算得DBE活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积（mL）为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 15000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

2、细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（10⁴个）︰提取液体积（mL）为 500~1000︰1 的比例（建议 500 万个细胞或细菌加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 15000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。（若溶液有浑浊则离心后取上清测定）

3、液体：直接检测。

二、测定步驟

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 将 10 mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg/mL 的标准溶液备用。

3、 取 100μL 样本沸水浴 5min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温后，8000g，常温离心 5min，取上清备用。

4、 操作表 (在 0.5mL 或 1.5mL 离心管中) ：

三、DBE活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的 ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将 ΔA 带入方程得到 x（mg/mL）。

2、 DBE 活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

DBE 酶活（U/mg prot）=x×V 提取÷（V 提取×Cpr）÷T=0.5x×Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：每克样本每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

DBE 酶活（U/g 质量）=x×V 提取÷W÷T=0.5x÷W

（3）按细胞或细菌数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细胞每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

DBE 酶活（U/10⁴ cell）=x×V 提取÷细胞数量（万个）÷T=0.5x÷细胞数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：每 mL 样本每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

DBE 酶活（U/mL）=x×V 样÷V 样÷T=0.5x

V 提取：提取液体积，1mL；V 样：加入的样本体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：2h。

1、 A 大于 1.5 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

2、 建议每次实验沸水浴后冷却时间保持一致。

1. 取 0.1g 大米，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 15000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测，取上清后再用提取液稀释 10 倍，之后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA=A 测定管-A 对照管=0.243-0.111=0.132，标准曲线 y=1.3913x-0.138，计算 x=0.194，按样本质量计算酶活得：

DBE 酶活（U/g 质量）=0.5x÷W×10（稀释倍数）=9.7 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！