NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)活性检测试剂盒 微量法

NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1．试剂二：临用前加入 500 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2．试剂三：临用前加入 600 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明：

MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，NADP-MDH主要存在于真核细胞中。

NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/ 96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 酶标仪/紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一置于37℃水浴中预热15min以上（保证无沉淀）。

3、 操作表

将上述试剂按顺序加微量石英比色皿/石英 96 孔板中，充分吹打混匀后立即记录 340nm 波长下初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，计算 ΔA 空白=A1 空白-A2 空白，ΔA 测定=A1 测定-A2 测定，计算 ΔA=ΔA测定-ΔA 空白。（空白管测 1-2 管即可）

三、NADP-MDH活力单位的计算

注意事项：

1、 样本的提取必须在 0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

2、 实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一 37℃放置。

3、 建议一人加样一人比色。因时间监测范围小，不推荐用 96 孔 UV 板同时测多个样本。

4、 用分光光度计时，当初始值小于 0.7 或者 ΔA 大于 0.5 时，建议稀释后测量。

实验实例：

1、 取 0.1g 心脏组织加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA测定管=A1 测定-A2 测定=0.7173-0.6399=0.0774，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.6583-0.6562=0.0021，ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.0753，按样本质量计算酶活得：

NADP-MDH（U/g 质量）=6430×ΔA÷W=6430×0.0753 ÷0.1=4841.79 U/g 质量。

2、 取 5μL 血清直接按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定= 0.6934-0.6854=0.008，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.6583-0.6562=0.0021，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.0059，按血清/血浆体积计算酶活得：

NADP-MDH（U/mL）=6430×ΔA=6430×0.0059=37.937 U/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！