磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性检测试剂盒 微量法

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂四：临用前加入 2 mL 双蒸水充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2、 试剂五：临用前加入 2 mL 双蒸水充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3、 试剂六原液：液体置于试剂瓶内 EP 管中；

4、 试剂六工作液配制：将试剂六原液：试剂六稀释液=1.6μL：328.4μL 稀释，用多少配多少；

5、 试剂七：临用前加入 5 mL 双蒸水，用不完的试剂可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

6、 工作液的配制：根据样本数量按体积比试剂二、试剂三、试剂四、试剂五、试剂六工作液、试剂七=15:15:15:15:19:19 的比例混合。工作液现用现配。

产品说明：

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心 20min。

2、细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：

在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 30℃水浴或培养箱 5min（酶标仪有控温功能的可将温度调至 30℃），拿出迅速擦干测定 310s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。（空白管只需做 1-2次）

三、PEPC酶活计算

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，ΔA 大于 0.6 时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时，可以延长反应时间（10min 或 15min）来测定。

2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。

实验实例：

1、 取 0.1g 天竺葵加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定=A1 测定-A2测定=1.013-0.9753=0.0377，ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.8407-0.8392=0.0015，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.0377-0.0015=0.0362，按样本质量计算酶活：

PEPC 酶活（U/g 质量）=321×ΔA÷W=321×0.0362÷0.1=116.202 U/g 质量。

2、 取 0.1g 芦荟加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定=A1 测定-A2测定=0.7049-0.6699=0.035，ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.8407-0.8392=0.0015，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.035-0.0015=0.0335，按样本质量计算酶活：

PEPC 酶活（U/g 质量）=321×ΔA÷W=321×0.0355÷0.1=107.535 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！