DPPH自由基清除能力检测试剂盒 微量法

DPPH 自由基清除能力检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：无水乙醇自备；

2、 试剂二：粉剂置于瓶内 EP 管中。临用前加入 4.05 mL 试剂一振荡溶解，用不完的试剂可于-20℃保存 1个月，建议分装保存，避免反复冻融；临用前根据试验所需量按照试剂二：试剂一（V:V）= 4：21 的比例配制成工作液，现配现用，用不完的工作液可于 2-8℃保存一周；

3、 试剂三：10 mg 维生素 C。临用前加入 1 mL 提取液，充分振荡溶解，配成 10 mg/mL 的维生素 C 溶液，2-8℃保存两周；用于阳性对照。

产品说明：

DPPH 自由基一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。

DPPH 自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在 515 nm 处有强吸收。当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，其溶液颜色变浅，515 nm 的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。本试剂盒中，通过吸光度下降的程度来反映样本清除 DPPH 自由基的能力。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50 目筛和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的制备（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

（1）植物样本的制备：将新鲜样本置于 60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过 30~50 目筛；称取约 0.05 g 样本，加入 1 mL 提取液后置于 40℃水浴锅中浸提 30 min；10000 rpm 室温离心 10 min，取上清，置于冰上待测。

（2）红酒、果汁等液体样本：吸取 100 μL 样本溶液加入 900 μL 提取液，旋涡振荡混匀，室温 10000 rpm 离心 10 min，取上清，置冰上待测。

（3）提取物或者药物：可用提取液配制成一定浓度，如 5 mg/mL。

注意：不同样本清除 DPPH 自由基的能力可能相差很大，为保证实验结果的准确性，样本要根据预实验结果进行适当调整（如清除率大于 90%，建议将提取的样本用提取液进行稀释；清除率小于 5%，建议加大烘干样本质量或液体样本体积进行提取）。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 515 nm，分光光度计用无水乙醇调零。

2、 阳性对照的准备：若需要线性关系，建议将 10 mg/mL 的维生素 C 溶液用提取液配制成 0.3、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL 的维生素 C 溶液待用，稀释可参考下表；若需要清除率约为 100%的阳性对照，则建议将 10 mg/mL 维生素 C 溶液用提取液配制成大于 0.3 mg/mL 的维生素 C 溶液待用。

    备注：实验中每个标准管需 10μL 试剂三。

3、操作表：在 96 孔板或 EP 管中分别加入下列试剂

三、计算公式

1、阳性对照的自由基清除率计算公式：

DPPH 自由基清除率 DVC% =[(A 空白-A 阳性对照)÷A 空白]×100%

2、样本的自由基清除率计算公式：

DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100%

注意事项：

1、 不同样本清除 DPPH 自由基的能力可能相差很大，如果要比较不同样本的 DPPH 自由基清除能力，建议对于同一批样本加入等量的样本，红酒、组织匀浆、果汁等液体样本加入同样体积，提取物（或者药物）配制成同样浓度。在比较时，将样本根据预实验结果进行适当调整，比较同样浓度（相同稀释倍数）的清除率大小。

2、 样本建议当天提取当天检测。

实验实例：

1、 称取 0.05g 益母草叶片加入 1mL 提取液进行样本处理，离心取上清后按测定步骤操作，用 96 孔板测得 A空白=1.229、A 对照=0.078、A 测定=0.300，根据计算公式得：

DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100%=81.9%。

2、 取 100μL 红酒加入 900μL 提取液进行样本处理，离心取上清后按测定步骤操作，用 96 孔板测得 A 空白=1.229、A 对照=0.051、A 测定=0.898，根据计算公式得：

DPPH 自由基清除率 D% =[[A 空白-(A 测定-A 对照)]÷A 空白]×100%=31.1%。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！