硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性检测试剂盒 微量法

硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂三：临用前取 1 支加入 1.667 mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃保存 1 周。

2、 试剂四：临用前根据样本数量将试剂四用无水乙醇稀释 10 倍后使用。

产品说明：

 TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP⁺，TNB 在 412nm 有特征吸收峰，但还原型谷胱甘肽与 DTNB同样能反应生成 TNB，因此本试剂盒利用 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，通过测定 412nm 波长处TNB 的增加速率，即可计算 TrxR 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待检测。

2、细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min），然后 10000rpm，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

注：测定前将上清液与试剂四以50：1的体积比混匀（即取100μL上清液加入2μL试剂四混合）37℃水浴30min后至冰上。

二、测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热 30min 后，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 试剂二，20μL 试剂三，160μL 试剂一，迅速混匀后于 412nm测定 10s 时的吸光度，37℃水浴 5min 迅速拿出测量 412nm 下的吸光度记为 A1 和 A2。计算 ΔA 空白管=A2-A1。

4. 测定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 试剂二，20μL 试剂三，140μL 试剂一，20μL 上清液，迅速

混匀后于 412nm 测定 10s 时的吸光度，37℃水浴 5min 迅速拿出测量 412nm 下的吸光度，记为 A3 和 A4。ΔA 测定管=A4-A3。

三、TrxR活性计算

注意事项：

1、 哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右；测定过程操作须迅速。

2、 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 0.1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1、 取 0.1g 月季花朵加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定管=A4-A3=0.8600-0.8177=0.0423，ΔA 空白管=A2-A1=0.0792-0.0727=0.0065，按样本质量计算酶活得：

TrxR（U/g 质量）=147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷W=5.26 U/g 质量。

2、 取 0.1g 肝脏加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心 10min，取上清稀释 4 倍置冰上，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定管=A4-A3=0.8538-0.2102=0.6436，ΔA 空白管=A2-A1=0.0792-0.0727=0.0065，按样本质量计算酶活得：

TrxR（U/g 质量）=147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷W×4（稀释倍数）=3746.148 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！