脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性检测试剂盒 可见分光光度法

脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

2、 试剂三：临用前加入 4 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

3、 试剂四：临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂可分装-20℃保存，避免反复冻融。

4、 工作液的配制：首先将试剂三和试剂四配成溶液，临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试剂三（V）=1.6（mL）：0.2（mL）：0.15（mL）的比例充分混匀。（注意：现配现用，用多少配多少）

产品说明：

ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。

ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的下降，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表ProDH活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL提取液一），进行冰浴匀浆，1500g 4℃离心 15min，取上清液于一支新的 EP 管中，加入 10μL 提取液二，涡旋混匀，冰浴放置 30min 后，15000g 4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2、细胞或细菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆，1500g 4℃离心 15min，取上清液于一支新的 EP 管中，加入 10μL 提取液二，涡旋混匀，冰浴放置 30min 后，15000g 4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，波长调至600nm，蒸馏水调零。

2、 工作液置于 37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴 5min。

3、 加样表（在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂）

三、ProDH酶活计算

注意事项：

1、ΔA大于0.6时或者A3大于1.5时建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。

2、控制A3在0.8以上，若A3小于0.8，建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。

3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.02。

实验实例：

1、 取 0.1g 稗草加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨，对样本进行处理，取上清稀释 2 倍，之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定=A3-A4=0.815-0.52=0.295，ΔA 空白=A1-A2=0.883-0.879=0.004，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.295-0.004=0.291，按样本质量计算酶活得：

ProDH（U/g 质量）=333.33×ΔA÷W×稀释倍数=333.33×0.291÷0.1×2=1939.981 U/g 质量。

2、 取 0.1g 兔子肾脏组织加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨，对样本进行处理，取上清后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定=A3-A4=0.94-0.619=0.321，ΔA 空白=A1-A2=0.883-0.879=0.004，ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.321-0.004=0.317，按样本质量计算酶活得：

ProDH（U/g 质量）=333.33×ΔA÷W =333.33×0.317÷0.1=1056.656 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！