谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测试剂盒 微量法

谷胱甘肽还原酶（GR）活性检测试剂盒说明书

 微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂三：临用前加入 2.0 mL 蒸馏水，混匀。

产品说明：

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，GR 是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH，有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外 GR 还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。

GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH，同时 NADPH 脱氢生成 NADP⁺；NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，相反 NADP⁺在该波长无吸收峰；通过测定 340nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、移液器、匀浆器/研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称约 0.1g 组织，加入 1.0 mL 试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min，取上清液，待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 340nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一置于 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）中预热 30min 以上。

3. 空白管：取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 10μL 试剂二，20μL 试剂三，170μL 试剂一，于 340nm 测定 10s和 190s 吸光度，记为 A 空 1 和 A 空 2。

4. 测定管：取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 10μL 试剂二，20μL 试剂三，20μL 上清液，150μL 试剂一，于 340nm测定 10s 和 190s 吸光度，记为 A 测 1 和 A 测 2。

注：样本测定 10s 时吸光度后，将比色皿放入 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）水浴，3min 后拿出，吸打混匀，立即测定 190s 时的吸光度。

三、GR 活性计算

注意事项：

1、 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

2、 试剂三须现配现用，配置完后，置于冰上；

3、 测定前须先用 1-2 个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2-5 倍；

4、 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 0.1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。

实验实例：

1、 取 0.1g 桃树叶片加入 1.0 mL 试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min，取上清液稀释 4 倍后按测定步骤检测，用微量石英比色皿测得 ΔA 测定管=A 测 1-A 测 2=1.0765-0.626=0.4505，ΔA 空白管=A 空 1-A 空 2=0，按样本质量计算酶活得：

GR 酶活(U/g 质量)=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W×4（稀释倍数）=9.66 U/g 质量。

2、 取 0.1g 大鼠肝脏加入 1.0 mL 试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min，取上清液稀释 8 倍后按测定步骤检测，用微量石英比色皿测得 ΔA 测定管=A 测 1-A 测 2=0.9916-0.5632=0.4284，ΔA 空白管=A 空 1-A 空 2=0，按样本质量计算酶活得：

GR 酶活(U/g 质量)=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W×8（稀释倍数）=18.37 U/g 质量

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！