单宁酶活性检测试剂盒 微量法

单宁酶活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取 1 支加入 1 mL 无水乙醇混匀溶解，用不完的试剂可以 2-8℃保存一周；（1 支粉剂溶解后可做 100T，为了延长使用时间，此产品多给 1 支粉剂）

2、 标准品：5 mg 没食子酸丙酯。临用前加入 1.178 mL 无水乙醇充分混匀溶解，配成 20 μmol/mL 的标准溶液，2-8℃保存两周。

产品说明：

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含单宁的植物，也广泛存在于微生物中，可以水解酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。

使用没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆。10000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。10000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至270nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。

2、 标准液的稀释：取5μL 20μmol/mL的标准溶液，加入1995μL提取液，充分混匀，配制成0.05μmol/mL标准液使用，现用现配。（实验中每管需要200μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

3、 对照管样本处理：吸取0.02mL样本于1.5mLEP管中作为对照管，沸水浴5min，冷却至常温待测。

4、 加样表（在1.5mLEP管中分别加入）

三、单宁酶活力计算

注意事项：

如果A测定大于1.5，可以适当加大稀释倍数，保证总体积0.2mL不变，如5μL上清液和195μL提取液（相当于F=200/5=40），计算公式中需改变F和V上清液的数值。

实验实例：

1. 取 0.1g 玉兰叶加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A 对照管-A 测定管=0.6631-0.6258=0.0373，按样本质量计算酶活得：

单宁酶（U/g 质量）=1000×ΔA÷A 标准÷W×F（稀释倍数）=1119 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！