NADP磷酸酶(NADPase)活性检测试剂盒 微量法

NADP 磷酸酶（NADPase）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格: 100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：用时加入 1.1 mL 试剂一充分溶解备用，现配现用。

2、 试剂三：用时加入 8 mL 双蒸水，溶解后 4℃可保存一周。

3、 试剂四：用时加入 8 mL 双蒸水，溶解后 4℃可保存一周。

4、 标准品：10 mmol/L 标准磷贮备液。将标准品 10 倍稀释，即取 1 mL 标准品加 9 mL 蒸馏水，充分混匀，配成 1 μmol/mL 标准磷应用液。

5、 定磷试剂的配制：按 H₂O：试剂三：试剂四：试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷试剂根据实验用量现用现配。

注意：配试剂最 好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

产品说明：

NADPase主要存在于植物组织中，是生物体内唯 一催化NADP+降解为NAD⁺的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。

NADPase能够催化NADP⁺水解为NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、匀浆器/研钵和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织样本：称取约0.1g样本，加提取液1.0 mL充分研磨，于4℃，8000g离心10min，取上清液置冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：酶促反应

3、 定磷：

三、NADPase酶活性计算

注意事项：

1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最 后用蒸馏水冲干净。最 好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。

2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1、 取 0.1 肝加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定=A测定-A 对照=0.265-0.254=0.011，ΔA 标准=A 标准-A 空白=0.533-0.047=0.486，按样本质量计算酶活得：

NADPase (U/g 质量) =0.25×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=0.25×0.011÷0.486÷0.1=0.057 U/g 质量。

2、 取 0.1g 狗尾巴草（块根)加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.336-0.107=0.229，ΔA 标准=A 标准-A 空白=0.533-0.047=0.486，按样本质量计算酶活得：

NADPase (U/g 质量) =0.25×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=0.25×0.229÷0.486÷0.1=1.18 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！