NADH氧化酶(NOX)活性检测试剂盒 微量法

NADH 氧化酶（NOX）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

试剂六：临用前加入 4.5 mL 双蒸水，用不完的试剂-20℃分装保存。

产品说明：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD⁺。该酶不仅参与NAD+的再生，而且与免疫反应密切相关。

NOX能够将NADH氧化为NAD⁺，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1) 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2) 将匀浆 600g，4℃离心 5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

3) 将上清液转移至另一 EP 管中，即胞浆提取物，用于线粒体中泄露 NOX 活性测定。

4) 沉淀即为线粒体，加入 200μL 试剂二和 2μL 试剂三，反复吹打充分混匀，用于 NOX 活性测定，并用于蛋白浓度测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2、 试剂四37℃保温放置。

3、 加样表：

将上述试剂按顺序在微量玻璃比色皿/96 孔板中操作，加入试剂六后立即混匀，同时开始计时，在 600nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中，准确反应 1 分钟。迅速取出比色皿并擦干，记录 1 分 20 秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A1-A2，记录 ΔA 测定、ΔA 对照，ΔA=ΔA 测定-ΔA 对照。96孔板放于就近的恒温箱中，有些酶标仪带有内控温度设置的请设置为 37℃，1 分钟后再次测量即可。

三、NOX 活力单位的计算

A 用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷(Cpr×V样) ÷T=2500×ΔA÷Cpr

V反总：反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1min。

B 用96孔板测定的计算公式如下

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA÷0.005×V反总÷(Cpr×V样) ÷T=5000×ΔA÷Cpr

V反总：反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间，1min。

注意事项：

1、粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操作完成，以防止酶变性失活。

2、比色皿中反应液的温度最好保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、实验时，试剂六样本在冰上放置，以免变性和失活。

5、因通过反应速率计算酶活，使用 96 孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数量。

6、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

7、附：使用样本质量计算公式

A、按微量玻璃比色皿计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX 上清（U/g 质量）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(W÷V 提取×V 样)÷T=2525×ΔA1÷W

NOX 沉淀（U/g 质量）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T=505×ΔA2÷W

NOX（U/g 质量）= NOX 上清+ NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W+505×ΔA2÷W

ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应总体积，0.25mL；V 样：加入样本体积，0.01mL；V

提取：加入试剂一体积，1.01mL；V 样总：沉淀重悬体积，0.202mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。

B、按 96 孔 UV 板计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 质量）=ΔA1÷0.005×V 反总÷(W÷V 提取×V 样)÷T=5050×ΔA1÷W

NOX（U/g 质量）=ΔA2÷0.005×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T=1010×ΔA2÷W

NOX（U/g 质量）= NOX 上清+ NOX 沉淀=5050×ΔA1÷W+1010×ΔA2÷W

ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应总体积，0.25mL；V 样：加入样本体积，0.01mL；V

提取：加入提取液体积，1.01mL；V 样总：沉淀重悬体积，0.202mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。

实验实例：

1、 取 0.1g 肺进行样本处理，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得 ΔA1=ΔA 测定-ΔA 对照=（0.8136-0.118）-（0.9216-0.8079）=0.5819，ΔA2=ΔA 测定-ΔA 对照=（0.8546-0.4736）-（0.9539-0.9121）=0.3392，按样本质量计算酶活得：

NOX 上清（U/g 质量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.5819÷0.1=14692.975

NOX 沉淀（U/g 质量）=505×ΔA2÷W=505×0.3392÷0.1=1712.96

NOX（U/g 质量）=NOX 上清+NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W

=2525×0.5819÷0.1+505×0.3392÷0.1=16405.935 U/g 质量。

2、 取 0.1g 叶片进行样本处理，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得 ΔA1=ΔA 测定-ΔA 对照=（0.8518-0.7998）-（0.886-0.8831）=0.0491，ΔA2=ΔA 测定-ΔA 对照=（0.872-0.8296）-（0.916-0.9149）=0.0413，按样本质量计算酶活得：

NOX 上清（U/g 质量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.0491÷0.1=1239.775

NOX 沉淀（U/g 质量）=505×ΔA2÷W=505×0.0413÷0.1=208.565

NOX（U/g 质量）=NOX 上清+NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W

=2525×0.0491÷0.1+505×0.0413÷0.1=1448.34 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！