蔗糖磷酸化酶活性检测试剂盒 微量法

蔗糖磷酸化酶（SP）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 6 mL 蒸馏水，充分混匀。4℃可以保存 4 周。

2、 试剂四：临用前取 1 支加入 0.6 mL 蒸馏水，充分混匀。分装后-20℃保存，避免反复冻融，可以保存 2 周；

3、 试剂五：粉剂置于瓶内玻璃管中。临用前加入 10 mL 蒸馏水，充分混匀。-20℃分装保存，避免反复冻融，可以保存 4 周；

4、 试剂六：临用前取 1 支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀（可做 100T，为保证试剂盒使用时间，故多给一支）；可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃可以保存 2 周；临用前按试剂六：蒸馏水=1:1 的比例稀释试剂六，现用现配；

5、 试剂七：临用前取 1 支加入 0.7 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃可以保存 2 周；临用前按试剂七：蒸馏水=1:1 的比例稀释试剂七，现用现配。

产品说明：

蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，属于糖基水解酶 13 家族，是一种催化转移葡萄糖苷键的酶，能够催化蔗糖和无机磷酸盐合成 1-磷酸-葡萄糖。该酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖为供体，多类物质如多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体，催化合成各种糖苷。SP 能够催化蔗糖产生 1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为 6-磷酸葡萄糖，在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原 NADP⁺生成 NADPH，导致 340nm 光吸收值增加。通过 340nm 吸光度的增加速率来反映 SP 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、研钵/匀浆器、微量石英比色皿/96孔 UV 板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5-10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min ，取上清置于冰上待测。

2、细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000︰1 的比例（建议 500 万个细胞或细菌加入 1 mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 200 W，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3 min）；然后 10000 g，4℃，离心 10 min ，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。若液体浑浊可离心后取上清测定。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 试剂一 37℃预热 10min。

3、 操作表：

二、SP 活性计算：

注意事项：

1、如果测定吸光值 A＞1，建议用提取液稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加样本量后再进行测定。

实验实例：

1、 称取 0.1 g 土豆，加入 1 mL 提取液，冰浴匀浆，10000 g，4℃条件下离心 10 min；取上清置于冰上待测。使用微量石英比色皿按照测定步骤操作，计算 ΔA=（0.4070-0.3117）-（0.0956-0.0949）=0.0946。计算活性：

蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 质量）=ΔA÷ε÷d×V 反总×10 ⁹÷(V 样÷V 样总×W)÷T =760.44 U/ g 质量

2、 称取 0.1 g 黑米，加入 1 mL 提取液，冰浴匀浆，10000 g，4℃条件下离心 10 min；取上清置于冰上待测。使用微量石英比色皿按照测定步骤操作，计算 ΔA =（0.4559-0.3546）-（0.0956-0.0949）=0.1006，计算活性：

蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 质量）=ΔA÷ε÷d×V 反总×10 ⁹÷(V 样÷V 样总×W)÷T =808.67 U/ g 质量

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！