海藻糖含量检测试剂盒 微量法

海藻糖含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、标准品：10 mg 海藻糖。临用前加 1 mL 蒸馏水，溶液浓度为 10 mg/mL，2-8℃保存两周；

2、工作液的配制：临用前取 1 瓶试剂一加入 3.5 mL 蒸馏水后，缓慢加入 14 mL 浓硫酸，不断搅拌，充分溶解，

待用。用不完的试剂 2-8℃保存一周。

产品说明：

海藻糖存在于大量有机体中，包括细菌、藻类、酵母、植物、昆虫和其他无脊椎动物。由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性，能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。

测定方法采用蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样本的测定等优点。但是蒽酮比色法也存在一定缺陷，如果样本中含有可溶性糖，则会影响测定。本试剂盒建议用于除海藻糖外不含其他可溶性糖样本的测定。

技术指标：

最 低检出限：0.0055 mg/mL

线性范围：0.00625-0.4 mg/mL

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机，可调式移液器、超声破碎仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、浓硫酸和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200w，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），室温静置 45min，振荡 3~5 次，冷却后，8000g，常温离心 10min，取上清。

2、 组织的处理：称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆或研碎，室温静置 45min，振荡 3~5 次，冷却后，8000g，常温离心 10min，取上清。

3、 血清（浆）的处理：吸取约 100μL 血清（浆），加入 0.9mL 提取液，充分混匀，室温静置 45min，振荡 3~5 次，

冷却后，8000g，常温离心 10min，取上清。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min，波长调节至 620nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 调节水浴锅至 95℃。

3、 标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释至 0.2、0.1、0.075、0.05、0.025、0.0125、0mg/mL

4、 标准品稀释表

实验中每个标准管需 60μL 标准溶液。

5、 标准曲线的建立：取 60μL 标准液和 240μL 现配的工作液混匀，95℃水浴 10 min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取 200μL 至比色皿或 96 孔板中，在 620nm 处测吸光值 A。ΔA 标准=A 标准-A 空白，根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度 ΔA 标准（y，ΔA 标准），建立标准曲线。

6、 样本测定：取 60μL 样本和 240μL 现配的工作液混匀，95℃水浴 10 min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取 200μL 至比色皿或 96 孔板中，在 620nm 处测定吸光度值为 A。

三、海藻糖含量计算

1. 根据标准曲线，将 ΔA 测定（y， A 测定）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）。

2. 按样本质量计算：

海藻糖含量(mg/g 质量)= V1×x÷(W×V1÷V2)= x÷W

3. 按样本蛋白浓度计算：

海藻糖含量(mg/mg prot)= V1×x÷(V1×Cpr)= x÷Cpr

4. 按细菌或细胞数量计算：

海藻糖含量(μg/10⁴ cell)= 1000×V1×x÷(500 × V1÷V2)= 2x

5. 血清（浆）海藻糖含量计算：

海藻糖含量（mg/mL）＝ V1×x÷(V3×V1÷V2)= 10x

V1: 反应体系中样本体积，0.06mL；V2：提取液总体积，1mL；V3：血清、血浆体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万；1000:单位换算系数，1mg/mL=1000ug/mL。

注意事项：

如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。计算时注意同步修改计算公式。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！