几丁质酶活性检测试剂盒微量法 微量法

几丁质酶活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂一：用前摇匀。

2、标准品：5mg N-乙酰氨基葡萄糖。临用前加入 2.27 mL 蒸馏水配成 10 μmol/mL 的标准溶液，2-8℃保存两周。

产品说明：

几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶（EC 3.2.1.14）可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物，在540nm 处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、研钵/匀浆器、蒸馏水、超声破碎仪。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织样本的处理：按照组织质量（g）：提取液体积 (mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清，置于冰上待测。

2、真菌样本的处理：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 200w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清，置于冰上待测。

3、培养液等液体样本的处理：直接测定。

二、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min。波长调至540nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、将标准溶液用蒸馏水稀释为5、4、3、2、1μmol/mL的标准溶液备用，具体稀释可参考下表：

1、 在EP管中分别加入：

三、 几丁质酶活的计算

1、根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

2、样本重量计算

酶活性定义：37℃下，每g组织每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/g 质量）=x×V样÷（V样÷V样总×W）÷T=x÷W

3、蛋白质浓度计算

酶活性定义：37℃下，每mg蛋白每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/mg prot）=x×V样÷（V样×Cpr）÷T =x÷Cpr

4、细胞数量计算

酶活性定义：37℃下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/10⁴ cell）=x×V样÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T =x÷细胞数量

5、培养液体积计算

酶活性定义：37℃下，每mL培养液每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/mL）=x×V样÷V样÷T =x

V样：反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL；T：反应时间，1h；细胞数量：以万计。

注意事项： 

1、 反应结束后尽快进行比色。 

2、 OD 值大于1.5，样本适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数；或者缩短37℃水浴时间到X小时（如0.5 小时），按照原先计算公式得到的结果再除以X。 

实验实例： 

1、 取 0.1g 虾壳加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.716-0.644=0.072，带入标曲 y=0.244x-0.1628，得出 x=0.9623，按样本质量计算酶活得： 几丁质酶活性（U/g 质量）=x÷W=0.9623÷0.1=9.623 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！