4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）活性检测试剂盒 微量法

4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（4CL）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格: 100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 提取液：内含不溶物，使用前摇匀；

2、 试剂二：临用前加入 3 mL 蒸馏水溶解，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3、 试剂四：临用前用 4 mL 蒸馏水溶解备用，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；

4、 试剂五：加入 1 mL 乙醇溶解，临用前用蒸馏水稀释 40 倍后备用，现用现配；

5、 工作液的配制：按体积比将试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=1:1:1:1 的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：

4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木质素生物合成的关键酶之一，主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶 A 酯，这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，其在 333nm 下测有特征吸收峰，测定 4-香豆酸 CoA 的生成速率，即可反映 4CL 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 333nm，蒸馏水调零。

2、 操作表（在 0.5mL EP 管中进行下列操作）：

三、4CL活性计算

注意事项：

1、 若 ΔA 大于 0.5，将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。

2、 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。

3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。

实验实例：

1、 取0.1g芥菜加1mL提取液进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A2测定管-A1 测定管=0.7425-0.5851=0.1574，ΔA 空白管= A2 空白管-A1 空白管=0，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1574，按样本质量计算酶活得：4CL（U/g 质量）=476.19×ΔA÷W=476.19×0.1574÷0.1=749.52 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！