α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性检测试剂盒 微量法

α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性检测试剂盒说明书

 微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1．试剂八：临用前加入 0.8 mL 双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃避光保存。

2．工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。

产品说明：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约 0.1g 组织或收集约 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，4 ℃ 11000g 离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、操作步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 空白管：

取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL蒸馏水，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。

3、 测定管：

取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。

三、α-KGDH活性计算

V反总：反应体系总体积，2.2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、 测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、 测定管的 ΔA 值在 0.01-0.25 之间，若测定管的 ΔA 值大于 0.25，需将样本进行稀释。

5、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1、 取0.1g稗草进行样本处理，将取上清稀释2倍后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A4-A3=0.3243-0.3115=0.0128，ΔA 空白=A2-A1=0，按样本质量计算酶活得：

α-KGDH（U/g 质量）=1488.5×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W×2（稀释倍数）=381.056 U/g 质量。

2、 取 0.1g 小鼠肝脏进行样本处理，4 ℃ 11000g 离心 10min，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定=A4-A3=1.2123-0.9623=0.2500，ΔA 空白=A2-A1=0，按样本质量计算酶活得：

α-KGDH（U/g 质量）=1488.5×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W=3721.25 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！