3-磷酸甘油酸激酶(PGK)检测试剂盒UV板微量法 微量法

3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解后待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

2、 试剂三：临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

4、 试剂五：粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入 4 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

5、 工作液的配制：按照蒸馏水：试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀，现用现配。

产品说明：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，引起 340nm 处的吸光度下降，即反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

血清/血浆：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定：(在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂)

三、PGK活性计算

注意事项：

1. ΔA 大于 0.8 或者 A1 测定小于 0.9 时（96 孔 UV 板是当 ΔA 大于 0.5 或者 A1 测定小于 0.6 时），建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时，可以延长反应时间（10min 或 15min）或增加样本体积来测定。

2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。

3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

实验实例：

1、 取 0.1g 白菜加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释 4 倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=1.05-0.5559=0.4941，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.9966-0.9941=0.0025，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.4941-0.0025=0.4916，按样本质量计算酶活得：

PGK（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.4916÷0.1×4=6322.7626 U/g 质量。

2、 取 0.1g 小鼠肌肉加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释 20 倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算，ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.9327-0.4518=0.4809，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.9966-0.9941=0.0025，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.4809-0.0025=0.4784，按样本质量计算酶活得：

PGK（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.4784÷0.1×20=30764.9472 U/g 质量。

3、 取骆驼血清样本 100μL 按照测定步骤直接测定，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=1.0435-0.9793=0.0642，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.9966-0.9941=0.0025，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.0642-0.0025=0.0617，按液体体积计算酶活得：

PGK（U/mL）=321.54×ΔA=321.54×0.0617=19.8390 U/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！