脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性检测试剂盒 微量法

脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性检测试剂盒说明书

 微量法

规格: 100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂二：临用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 2 周。

2、试剂三：粉剂置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 3.5 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

3、标准品：临用前加入 1 mL 蒸馏水，配制成 10 mg/mL 的标准溶液。

产品说明：

脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）是植物体内一种重要的抗氧化酶，是抗坏血酸谷胱甘肽氧化循环中促进抗坏血酸再生的关键酶。DHAR 在循环中利用抗坏血酸维持植物体内抗坏血酸的正常代谢水平，保护细胞组分抵御氧化损伤方面发挥着重要作用。

DHAR 催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原脱氢抗坏血酸（DHA）生成 AsA，GSH 能和 5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。TNB 在波长 412nm 处具有最大光吸收。通过测定 GSH 的减少速率，计算 DHAR 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

研钵/匀浆器、冰、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加提取液 1 mL），冰上充分研磨匀浆，8000 g，4℃，离心 10 min，取上清液置于冰上待测。

2. 细菌、细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1 mL 提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3 min）；然后 8000 g，4℃，离心 10min，

取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零。

2、 标准溶液的配制：将 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL的标准溶液备用。

3、 加样表

三、DHAR 活性计算

1、标准曲线的绘制：以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将 ΔA 带入方程得到 x（mg/mL）。

2、DHAR 活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。

DHAR (U/mg prot) = x×V 提取÷（V 提取×Cpr）×10³÷T=50x÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活定义：每克样本每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。

DHAR (U/g 质量) = x×V 提取÷W×10³÷T =50x÷W

（3）按细胞数量计算：

酶活定义：每 10⁴ 个细胞（细菌）每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。

DHAR (U/10⁴ cell) = x×V 提取÷细胞数量（万个）×10³÷W÷T =50x÷细胞数量（万个）

（4）按血清等液体计算：

酶活定义：每 mL 样本每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。

DHAR（U/mL）= x×V 样÷V 样×10³÷T = 50x

V 提取：提取液体积，1mL；10³：单位换算系数，1mg=10³μg；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：20min；V 样：加入样本体积，0.02mL。

实验实例：

1、 取 0.1g 商陆加入 1mL 提取液冰上充分研磨匀浆，8000 g，4℃ 离心 10 min，取上清液置于冰上，按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA=（A 空白管-A 空白对照管）-（A 测定管-A 对照管）=（1.169-0.088）-（0.974-0.357）=0.464，标准曲线 y=3.2972x+0.0011，依据标准曲线计算 x=0.1404mg/mL，按样本质量计算酶活得：

DHAR(U/g 质量) =50x÷W=70.2 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！