脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格: 100T/48S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060703093661332](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060703093661332.png)
溶液的配制:
1、试剂二:临用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周。
2、试剂三:粉剂置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 3.5 mL 蒸馏水充分溶解,4℃保存。
3、标准品:临用前加入 1 mL 蒸馏水,配制成 10 mg/mL 的标准溶液。
产品说明:
脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbate reductase,DHAR)是植物体内一种重要的抗氧化酶,是抗坏血酸谷胱甘肽氧化循环中促进抗坏血酸再生的关键酶。DHAR 在循环中利用抗坏血酸维持植物体内抗坏血酸的正常代谢水平,保护细胞组分抵御氧化损伤方面发挥着重要作用。
DHAR 催化还原型谷胱甘肽(GSH)还原脱氢抗坏血酸(DHA)生成 AsA,GSH 能和 5,5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。TNB 在波长 412nm 处具有最大光吸收。通过测定 GSH 的减少速率,计算 DHAR 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、冰、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液器和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5-10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加提取液 1 mL),冰上充分研磨匀浆,8000 g,4℃,离心 10 min,取上清液置于冰上待测。
2. 细菌、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500-1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1 mL 提取液),冰浴超声破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7s,总时间 3 min);然后 8000 g,4℃,离心 10min,
取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长到 412nm,蒸馏水调零。
2、 标准溶液的配制:将 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL的标准溶液备用。
3、 加样表
![image 2022060703103922280](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060703103922280.png)
三、DHAR 活性计算
1、标准曲线的绘制:以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(mg/mL)。
2、DHAR 活性的计算:
(1)按蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。
DHAR (U/mg prot) = x×V 提取÷(V 提取×Cpr)×103÷T=50x÷Cpr
(2)按样本质量计算:
酶活定义:每克样本每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。
DHAR (U/g 质量) = x×V 提取÷W×103÷T =50x÷W
(3)按细胞数量计算:
酶活定义:每 104 个细胞(细菌)每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。
DHAR (U/104 cell) = x×V 提取÷细胞数量(万个)×103÷W÷T =50x÷细胞数量(万个)
(4)按血清等液体计算:
酶活定义:每 mL 样本每分钟催化 1μg GSH 氧化为 1 个酶活力单位。
DHAR(U/mL)= x×V 样÷V 样×103÷T = 50x
V 提取:提取液体积,1mL;103:单位换算系数,1mg=103μg;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:20min;V 样:加入样本体积,0.02mL。
实验实例:
1、 取 0.1g 商陆加入 1mL 提取液冰上充分研磨匀浆,8000 g,4℃ 离心 10 min,取上清液置于冰上,按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA=(A 空白管-A 空白对照管)-(A 测定管-A 对照管)=(1.169-0.088)-(0.974-0.357)=0.464,标准曲线 y=3.2972x+0.0011,依据标准曲线计算 x=0.1404mg/mL,按样本质量计算酶活得:
DHAR(U/g 质量) =50x÷W=70.2 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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