乙酰辅酶A羧化酶试剂盒微量法 微量法

乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1．试剂二：临用前将试剂二 B、试剂二 C 倒入试剂二 A，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2．试剂三：临用前加入 2 mL 双蒸水，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3．试剂四：临用前加入 5 mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周；

4．试剂五：临用前加入 5 mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周；

5．提取液的配制：按提取液一：提取液二= 990：10（V：V）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用；

6．标准品：10 μmol/mL 标准磷贮备液；

7．工作液（定磷剂）的配制：按 H₂O：试剂四：试剂五：试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的工作液应为浅黄色；若变色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，工作液应现配现用；

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

产品说明：

乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO₃和ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷，钼蓝与磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物质，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、水浴锅、蒸馏水、冰盒、EP 管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

2、细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3、血清（浆）：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。

2、 临用前将试剂一、试剂二、试剂三在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 10min。

3、 将 10μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的标准溶液备用。

4、 操作表：

三、ACC 活性计算

注意事项：

1、 工作液（定磷剂）应现配现用，正常颜色为浅黄色，如有变色或变蓝则均为失效。

2、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管或 EP 管等试验器材均要求严格无磷。

3、 显色结束后应立即检测。

4、 当 ΔA 大于 1.5 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

5、 由于提取液中含有蛋白（约 1mg/mL），若需要测定样本的蛋白浓度，需要减去提取液本身的蛋白浓度。

实验实例：

1. 取0.1g苦麻菜，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，然后8000g 4℃离心10min，取上清，之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA=A测定管-A对照管=0.326-0.079=0.247，标准曲线y=0.4799x+0.0004，则x=0.5139，按样本质量计算酶活得：

ACC酶活（U/g 质量）=20x÷W=102.78 U/g 质量。

2. 取 0.1g 肝脏组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 8000g 4℃离心 10min，之后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA=A 测定管-A 对照管=0.27-0.163=0.107，标准曲线 y=0.4799x+0.0004，则 x=0.2221，按

样本质量计算酶活得：

ACC 酶活（U/g 质量）=20x÷W=44.42 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！