羧酸酯酶(CarE)活性检测试剂盒 微量法

羧酸酯酶（CarE）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前先加入 1.25mL 无水乙醇，震荡使其大部分溶解，再加入 8.75mL 试剂三，震荡至充分溶解；

2、 试剂二：临用前取 16 mL 试剂三加入试剂二瓶中震荡使其充分溶解，临用前配制。本试剂溶解后为淡黄色，且在常温下不稳定，建议根据样本量取适当配好的试剂二置于冰上待用，剩余试剂分装后置于-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：

哺乳动物 CarE，也称脂族酯酶（aliesterase），广泛分布于组织和器官，属于丝氨酸水解酶家族。CarE 催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解，但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE 参与脂质运输和代谢，并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关，有机磷农药可结合并且抑制 CarE 活性。

CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固蓝显色；在 450nm 光吸收增加速率，计算 CarE 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）；然后15000rpm，4℃，离心10min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待检。

组织：按照组织质量（g）: 提取液体积(mL)为1 : 5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000rpm，4℃，离心10min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待检。

血清：直接测量。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一置于37℃水浴中预热10 min以上，试剂二在检测过程中需置于冰上待用。

3、 在微量玻璃比色皿或96孔板中进行如下操作：

将上述试剂按照先后顺序分别加入微量比色皿或 96 孔板中，加入试剂一即开始计时，迅速混匀后，测定第 10s的吸光值记为 A1 空和 A1 测，37℃条件下准确反应 5min，测定 310s 的吸光值，记为 A2 空、A2 测。计算 ΔA 空白管=A2 空-A1 空，ΔA 测定管=A2 测-A1 测。（空白管只需做 1~2 次）

（注意：本试剂盒反应时应保持 37℃的环境，一般酶标仪有控温功能，可直接设置成 37℃，待温度上升至 37℃后即可开始试验；若用没有控温装置的分光光度计，则可以用恒温水浴锅辅助反应，具体操作如下：将上述试剂按照先后顺序分别加入比色皿中，加入试剂一即开始计时，迅速吹打混匀，记录第 10s 的吸光值 A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中准确反应 5min，之后迅速取出比色皿并擦干，记录 310s 时的吸光度 A2，计算ΔA=A2-A1。）

三、CarE 活性计算

注意事项：

1、 试剂二为-20℃储存试剂，在常温下不稳定，一般常温放置 2-3 小时即可明显发现液体由浅黄色变为浅褐色（液体变褐色视为变质，不可用）。建议试验前根据样本量计算所需试剂二的用量，在试剂二溶解后，留取所需用量置于冰上待用，剩余试剂可分装后-20℃储存。

2、 动物组织样本一般稀释 8 倍或更大稀释倍数后进行操作测定。

3、 当吸光值大于 1 时，建议将样本稀释后测量。计算公式注意乘以稀释倍数。

4、 为保证反应时间的准确性，建议逐一比色；如想用 96 孔板对多样本同时检测，建议使用排枪，且一次最多 8个或 12 个孔（8 道排枪或 12 道排枪）。

实验实例：

1、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清用蒸馏水稀释 32 倍后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA 空白管=A2 空-A1 空=0.148-0.122=0.026，ΔA 测定管=A2 测-A1 测=0.457-0.118=0.339，按样本质量计算酶活得：

CarE 酶活(U/g 质量)=8×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W×F=8×(0.339-0.026)÷0.1×32=801.28 U/g 质量。

2、 取 0.1g 小鼠肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清用蒸馏水稀释 8 倍后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA 空白管=A2 空-A1 空=0.148-0.122=0.026，ΔA 测定管=A2 测-A1 测=0.28-0.124=0.156，按样本质量计算酶活得：

CarE 酶活(U/g 质量)=8×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ×F=8×(0.156-0.026)÷0.1×8=83.2 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！