α-甘露糖苷酶（α-man）活性检测试剂盒 可见分光光度法

α-甘露糖苷酶(α-man)活性检测试剂盒说明书

 可见分光光度法

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前每支加入 1mL 试剂四溶解，溶解后的试剂在-20℃分装保存，可以保存 4 周。

2、 标准品：5mmol/L 的对硝基苯酚标准液。

产品说明：

α-man 分布广泛、种类繁多，在真核生物胞质、内质网、高尔基体、溶酶体中都有发现，不同种类、功能的 α-man共同参与 N-聚糖的修饰过程。

α-man 和特定底物发生反应，其生成物在 405nm 处有特征吸收峰，根据吸光度的变化率可计算出 α-man 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、匀浆器/研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 12000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

2、细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000︰1 的比例（建议 500 万个细胞或细菌加入 1 mL 提取液）进行提取，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 200 W，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3 min）；然后 12000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。若有浑浊可以离心后测定

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 405 nm，蒸馏水调零。

2、 将 5mmol/L 的对硝基苯酚标准液用蒸馏水稀释为 0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0.005mmol/L的标准溶液备用。

3、 操作表：(在 1.5 mL 离心管中)

三、α-甘露糖苷酶(α-man)活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的 ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y＝kx+b，将 ΔA 带入方程得到 x（mmol/L，即 μmol/mL）。

2、 α-甘露糖苷酶活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 蛋白每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mg prot）= x×V 样÷（V 样×Cpr）÷T×F= x×0.1÷ Cpr ×F

（2）按样本质量计算

酶活定义：每 g 样本每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 质量）= x×V 样÷（W×V 样÷V 提取）÷T×F= x×0.1÷W×F

（3）按照细胞或细菌数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细胞每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/10⁴ cell）= x×V 样÷（细胞数量×V 样÷V 提取）÷细胞数量（万个）÷T×F

= x×0.1÷ 细胞数量（万个）×F

（4）按液体体积计算

酶活定义：每 mL 样本每分钟产生 1 μmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mL）＝x×V 样÷V 样÷T×F= x×0.1×F

V 提取：提取液体积，1 mL；V 样：加入的样本体积，0.125 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，10 min； F：稀释倍数。

注意事项：

1、如果测定吸光值 A＞1.5 或 ΔA＞1，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加样本量后再进行测定。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！