外切 β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶(C1)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/b1b65d1c-966e-4c2f-8ff9-f4f56be1c445.jpg)
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前取 1 瓶加入 7 mL 蒸馏水溶解备用,现用现配;用不完的试剂 2-8℃保存 4 周;
2、 标准品:5 μmol/mL 对硝基苯酚溶液。
产品说明:
β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶(C1,EC3.2.1.91)存在于细菌、真菌和动物体内,是微生物纤维素降解酶系的主要组分,也是水解天然纤维素的必需组分,C1 酶作用于纤维素线状分子的末端,水解 β-葡萄糖苷键,每次切下 1 个纤维二糖分子。
C1 能够催化对硝基苯纤维二糖苷 (PNPC)生成对硝基苯酚,后者在 400 nm 有特征光吸收。
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/53e3a9e7-83c8-4336-a2a2-02244ca70ab2.jpg)
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1 mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆。然后 10000g,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。
2、细菌、真菌:按照细胞数量 104个︰提取液体积(mL)500~1000 : 1 的比例(建议 500 万细胞加入 1 mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 7s,总时间 3 min),然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测。
3、血清(浆)等液体:直接测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 400 nm,蒸馏水调零。
2、 标准溶液的稀释:取 50μL 5 μmol/mL 对硝基苯酚溶液,加入 950μL 蒸馏水,充分混匀,配制成 0.25μmol/mL 标准液使用,现用现配。(实验中每管需要 100μL,为减小实验误差,故配制大体积。)
3、 操作表(在 1.5 mL 离心管中依次加入下列试剂):
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/894959d8-dfc8-4041-85c1-388040b28283.jpg)
三、C1 酶活计算
1、按照样本蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 蛋白在反应体系中每小时生成 1 nmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
C1(U/mg prot)=ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标)×1000×V 样÷(Cpr×V 样)÷T=250×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
2、按照样本质量计算
酶活定义:每 g 样本在反应体系中每小时生成 1 nmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
C1(U/g 质量)= ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标)×1000×V 样÷(V 样÷V 样总×W)÷T=250×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
3、按照细菌或真菌数量计算
酶活定义:每 104 个细菌或真菌在反应体系中每小时生成 1 nmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
C1(U/104 cell)= ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标)×1000×V 样÷(细菌或真菌数量×V 样÷V 样总)÷T
=250×ΔA 测定÷ΔA 标准÷细菌或真菌数量
4、按液体体积计算
酶活定义:每毫升液体在反应体系中每小时催化生成 1 nmol 对硝基苯酚为一个酶活力单位。
C1(U/mL)= ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标)×1000×V 样÷V 样÷T=250×ΔA 测定÷ΔA 标准
C 标:标准溶液浓度:0.25 μmol/mL;V 样:加入的样本体积,0.1 mL;V 样总:加入的提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,1 h;细菌或真菌数量:以万计;W:样本质量,g;1000:换算系数,1μmol=1000 nmol。
注意事项:
1、若吸光度大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后进行测定。计算公式乘以稀释倍数。
实验实例:
1、 取 0.1g 金针菇进行样本处理,离心取上清稀释 5 倍后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.531-0.006=0.525,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管=0.305,根据样本质量计算酶活得:
C1(U/g 质量)=250×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W×5(稀释倍数)=250×0.525÷0.305÷0.1×5=21516.4 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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