线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性检测试剂盒 微量法

线粒体复合体Ⅰ活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 1 mL 丙酮；

2、 试剂三：溶于 1 mL 丙酮，可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮 100 倍稀释后使用，现用现配；

3、 试剂四：临用前加入 2 mL 蒸馏水，现配现用；

4、 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1:1 混合，现配现用。

产品说明：

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板（UV 版）、研钵/匀浆器、丙酮、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。

2. 4℃ 600 g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g 离心 15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入 400μL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅰ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。

3. 操作表：在微量石英比色皿/96孔板（UV版）中分别加入

三、复合体Ⅰ活力单位的计算

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于 1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若 ΔA 大于 0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若 ΔA 偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

4. 本试剂盒试剂足够完成 100 管反应。

5. 附：使用样本重量计算公式：（样本检测数为 100T/48S）

实验实例：

1、 取 0.1g 小鼠肺进行样本处理，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得 ΔA1=A1-A2=1.4505-1.2163=0.2342，ΔA2=A1-A2=1.499-1.398=0.101，按样本质量计算得：

上清中复合体 I 活性（U/g 质量）=1608×ΔA1÷W=1608×0.2342÷0.1=3765.936 U/g 质量

沉淀中复合体 I 活性（U/g 质量）=643×ΔA2÷W=643×0.101÷0.1=649.43 U/g 质量

则复合体 I（U/g 质量）=1608×ΔA1÷W +643×ΔA2÷W=1608×0.2342÷0.1+643×0.101÷0.1=4415.366 U/g 质量。

2、 取 0.1g 玉兰进行样本处理，上清液和沉淀都稀释 4 倍，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得 ΔA1=A1-A2=1.3518-1.3348=0.017，ΔA2=A1-A2=1.4269-1.4115=0.0154，按样本质量计算得：

上清中复合体 I 活性（U/g 质量）=1608×ΔA1÷W×4（稀释倍数）=1608×0.017÷0.1×4=1093.44 U/g 质量

沉淀中复合体 I 活性（U/g 质量）=643×ΔA2÷W×4（稀释倍数）=643×0.0154÷0.1×4=396.088 U/g 质量

则 复 合 体 I（ U/g 质 量 ） =1608×ΔA1÷W×4（ 稀 释 倍 数 ） +643×ΔA2÷W×4（ 稀 释 倍 数 ）

=1608×0.017÷0.1×4+643×0.0154÷0.1×4=1489.528 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！