柠檬酸合酶(CS)活性检测试剂盒 微量法

柠檬酸合酶（CS）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂五：临用前加入 500 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2、 试剂六：临用前加入 1.5 mL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明：

CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸光值。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1) 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2) 将匀浆液600g，4℃离心5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

3) 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS。

4) 在沉淀中加入200μL试剂一和2μL试剂二，反复吹打充分混匀，用于CS测定，并用于蛋白浓度测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、 试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热10min左右（保证无沉淀）。

3、 操作表：在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入

将上述试剂按顺序加入微量玻璃比色皿/96孔板中，加试剂六的同时开始计时，记录412nm波长下10秒时的初始吸光度A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟（96孔板放入恒温箱中）；迅速取出比色皿并擦干，412nm下记录2分10秒时的吸光度A2，并计算测定管的ΔA1=A2-A1，对照管的ΔA1’=A2-A1，ΔA=ΔA1-ΔA1’。

三、CS 活性计算

A、按微量玻璃比色皿计算：

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃或25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CS（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷（Cpr×V样本）÷T=1050×ΔA÷Cpr

ε：TNB的消光系数，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应体系总体积，0.2mL；d：比色皿光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.007mL； T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

B、按96孔板计算：

将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最 好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、用 96 孔板测定时，根据测定管数量配制测定管工作液（试剂三、四、五、六）和对照管工作液（试剂三、四），因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测多个样本。

5、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

6、附：使用样本鲜重计算公式：

A、按微量玻璃比色皿计算

单位的定义：37℃或25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CS上清（U/g 质量）=ΔA上清÷（ε×d）×V反总÷（W×V样本÷V提取）÷T=1061×ΔA上清÷W

CS沉淀（U/g 质量）=ΔA沉淀÷（ε×d）×V反总÷（W×V样本÷V样总）÷T=212×ΔA沉淀÷W

CS（U/g 质量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W

ΔA上清：上清测定值；ΔA沉淀：沉淀测定值；ε：TNB的消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应

体系总体积，0.2 mL；d：比色皿光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.007mL；V提取：提取液体积，1.01mL；V

样总：溶解沉淀的总体积，0.202mL；T：反应时间，2min；W：样本质量，g。

B、按96孔板计算

将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

实验实例：

1、 取 0.1g 小鼠心脏样本加入 1mL 提取液和 10μL 试剂二进行匀浆研磨，取上清后再离心，取上清，取沉淀后加入 200μL 试剂一和 2μL 试剂二，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测吸光度后计算上清中：ΔA1=A2-A1 =1.4577-0.8015=0.6562，ΔA1’=A2’-A1’=0.7842-0.7331=0.0511，ΔA 上清=ΔA1-ΔA1’=0.6051；沉淀中：ΔA1=A2 -A1 =0.4166-0.1303=0.2863，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA 沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.2863，按样本质量计算酶活得：CS（U/g 质量）= CS 上清+CS 沉淀=1061×ΔA 上清÷W+212×ΔA 沉淀÷W

= 1061×0.6051÷0.1+212×0.2863÷0.1=7027.067 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！