肌酸含量检测试剂盒 微量法

肌酸含量检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

标准品：1 mg 一水肌酸。临用前加入 1 mL 蒸馏水，充分溶解，即 1 mg/mL 一水肌酸标准储备液。用不完的

试剂 4℃保存一个月。

产品说明：

肌酸(Creatine)是一种含氮化合物，自然存在于脊椎动物体内，能够辅助为肌肉和神经细胞提供能量。肌酸可由精氨酸（arginine)、甘氨酸（glycine）及甲硫氨酸（methionine）三种氨基酸合成，可由人体自行合成，也可以从食物中摄取。大约 95%的肌酸存在于骨骼肌中，主要存在形式为磷酸肌酸。肌酸作为一种补充剂主要通过增加肌肉质量，增强运动表现能力。肌酸也被作为神经肌肉疾病的一种治疗药被广泛研究，它可能有助于保护神经和改善细胞生物功能状态。

肌酸可在碱性条件下与联乙酰-α-萘酚发生反应，生成红色产物在 530 nm 处有吸收峰。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞样本的制备：按照细胞数量（10⁴个）: 提取液一体积（mL）为 500~1000 : 1 的比例（建议500 万细胞加入 1 mL 提取液一）加入提取液一，冰浴超声波破碎细胞（功率 300W，超声 3 秒，间隔 9 秒，总时间 5 min）；于 4℃，12000 g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，4℃，12000 g 离心 10min 后取上清待测。

2、组织样本的制备：按照质量（g）: 提取液一体积(mL)为 1: 5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入1mL 提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于 4℃，12000 g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

3、血清（浆）：取 100 μL 血清（浆）加入 1mL 提取液一，4℃，12000 g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 530 nm，蒸馏水调零。

2、 标准溶液配制：将 1 mg/mL 一水肌酸标准储备液，用蒸馏水稀释至 200、160、130、100、50、25、12.5μg/mL 标准溶液待用。

3、 按下表步骤加样：

注：空白管只需做 1-2 次。

三、肌酸含量计算

1、 标准曲线绘制：以肌酸标准溶液浓度为横坐标（x，μg/mL），以 ΔA 标准为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到

线性回归方程 y=kx+b，将 ΔA 测定带入方程求得 x（μg/mL）。

2、 计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

肌酸含量（μg/mg prot）=x×V 样÷（V 样×Cpr）×0.879=x÷Cpr×0.879

（2）按照样本质量计算

肌酸含量（μg/g 质量）=x×（V 上清+V 提取液二）÷ （W×V 上清÷V 提取液一）×0.879=1.044×x÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

肌酸含量（μg/10⁴ cell）= x×（V 上清+V 提取液二）÷（细胞数量×V 上清÷V 提取液一）×0.879

= 1.044×x÷细胞数量

（4）按照血清（浆）体积计算

肌酸含量（μg/mL）=x×（V 上清+V 提取液二）÷ [V 液体×V 上清÷（V 提取液一+V 液体）]×0.879=11.482×x

V 样：加入样本体积，20 μL=0.02 mL；V 上清：提取液一提取时上清液体积，0.8 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞或细菌数量，以 10⁴计；V 提取液一：加入提取液一体积，1 mL；V 提取液二：加入提取液二体积，0.15 mL；V 液体：液体样本体积，0.1 mL；0.879：换算系数，一水肌酸相对分子质量 149.15，无水肌酸相对分子质量 131.13，0.879=131.13÷149.15。

注意事项：

1、显色完成后，请在 10 min 之内完成检测。

2、提取液中含有蛋白沉淀剂，提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酸含量需要另取样本，即取相同质量的组织、同等数目的细菌或细胞，用 1.1875mLPBS（生理盐水）匀浆；取相同体积的血清（浆），用 1.206mLPBS（生理盐水）匀浆（相当于提取步骤最终样本上清液），用 BCA 法进行蛋白浓度测定。

3、如果测定吸光值低于或超过标准溶液线性范围的吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

4、试剂一、试剂二对人体有刺激性，请采取适当的防护措施。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴乳胶手套操作。

实验实例：

1、 取 0.1g 兔肾脏加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清后按照测定步骤操作，用 96 孔板测定后计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.128-0.064=0.064，带入标准曲线 y=0.0062x0.0143，计算 x=12.629。按样本质量计算含量得：

肌酸含量（μg/g 质量）=1.044×x÷W =131.85 μg/g 质量。

2、 取 100μL 牛血清加入 1mL 提取液一，离心取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，用 96 孔板测定后计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.271-0.07=0.201，带入标准曲线 y=0.0062x-0.0143，计算 x=34.726。按照液体体积计算含量得：

肌酸含量（μg/mL）=11.482×x= 398.7 μg/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！